中华医学杂志2000年第80卷第6期

刘杰连兆瑞潘静波胡家露朱明华 窦科峰丁杰吴开春樊代明Mark Feitelson

摘要目的克隆乙型肝炎病毒X抗原 （HBxAg）相关肝癌差示表达基因并做功能研究。方法(1)用逆转录病毒方法建立表达HBxAg细胞模型。(2)用抑制差减杂交做基因差示表达分析。(3)做RNA印迹分析（Northern Blot）及原位分子杂交筛选基因探针。(4)用5′和3′迅速末端扩增法（RACE PCR）进行全长基因序列扩增，并进行体外蛋白翻译及制备抗体，做蛋白质印迹（Western Blot）分析。(5)进行该基因细胞内转导，进行功能研究。结果共得到10个cDNA探针，其中8个因HBX表达上调，2个表达下降。 经筛选及全长基因扩增，得到1个全长为1.35 kb、编码113个氨基酸的全长基因 C2，和蛋白翻译起始因子（Suil）同源，其表达被HBX抑制。初步功能研究显示，此基因对细胞生长具有抑制作用 ，并且正常肝组织中其mRNA信号明显高于肝癌组织。结论我们不仅克隆出HBX相关基因C2并进行了功能研究，还首次提出DNA病毒（HBV）能通过对细胞蛋白翻译水平的调节而导致癌变的机理。

关键词：肝肿瘤杂交DNA，互补乙型肝炎病毒X抗原

乙型肝炎病毒（HBV）尤其是乙型肝炎病毒X抗原(HBxAg)和肝癌发病密切相关。实验研究显示HBX不仅能体外转化鼠的肝细胞株，并能和p53抑癌基因结合而抑制其功能^［1］。更有实验证实，HBX因能改变和调节一些转录因子的活性及通过改变信号传导途径，在转录调节水平上介导肿瘤形成^［2］。因此，本实验目的就是通过用乙型肝炎病毒X(HBVX)基因转染肝纤维母细胞株（HepG2细胞）而建立表达HBxAg的细胞模型来研究宿主细胞因HBxAg的转入而在基因水平上的变异,对有差异的其中1个基因片断，进一步克隆出了全长基因序列并做了初步功能分析。

材料与方法

一、HBX逆转录病毒质粒载体(pSLXCMVHBV-X)及氯霉素乙酰转移酶逆转录病毒质粒载体(pSLXCMVCAT)的构建

HBVX基因pSLXCMVHBV-X表达载体及氯霉素乙酰转移酶基因pSLXCMVCAT表达载体均由美国Thomas Jefferson大学病理及细胞生物学实验室构建。 此两种重组细胞内表达载体均在真核细胞启动子（CMV）启动子调控之下。在转化细菌（HB101）后，进行序列鉴定。

二、重组逆转录病毒HepG2细胞的感染

用磷酸钙共沉淀法将15 μg的pSLXCMVHBX及pSLXCMV CAT感染大约1×10⁶ PA317包装细胞。用5 ml富含重组逆转录病毒的上清感染HepG2细胞，经G418 2周筛选后，挑选阳性克隆。

三、抑制性cDNA差减杂交，cDNA探针克隆及测序

用抑制性差减杂交试剂盒(美国，Clontech公司产品)做上述经乙型肝炎病毒X基因(HepG2X)及氯霉素乙酰转移酶基因(HepG2CAT)的cDNA文库的差示筛选，详见操作手册。将上述抑制性PCR产物用胶提试剂盒纯化(美国，Qiagen公司产品)，连结到T载体(美国，Novagen公司产品)，通过转染大肠杆菌后纯化质粒DNA做序列测定，并在基因库中做比较。

四、RNA印迹法(Northern Blot)分析杂交产物

抽提细胞总RNA（美国，Qiagen公司试剂盒）并转移至硝酸纤维素滤膜，以³²P随机引物标记法标记每一个探针（美国，Promega公司），在严格条件下进行杂交。洗膜后做放射自显影。用G3PDH做内源性对照。

五、原位分子杂交

将抑制差减杂交所得cDNA探针，用地高辛缺口翻译标记法标记后（德国，BOEHRINGER MANNHEIM公司试剂盒），在细胞株及冰冻切片标本上做原位分子杂交。具体方法用Oncor原位分子杂交试剂盒（美国，Oncor公司产品）。

六、临床病例标本

23例临床肝癌和癌旁正常组织均取自西京医院，所有标本均为新鲜手术标本，手术切除后立即放于液氮和-80℃冰箱中备用。

七、全长基因C2的克隆

全长cDNA克隆的获得用马拉松cDNA全长基因扩增试剂盒的5′和3′末端迅速扩增（RACE）PCR（美国，Clontech公司试剂盒）,首先合成3′和5′特异性引物，用子宫cDNA文库作为模板，用3′和5′基因特异性引物分别和连接子引物配对，用递减（touchdown） PCR分别得到3′末端和5′末端产物。将此产物分别克隆到T载体(美国，Novagen公司产品)测序。在重叠部分找出适当酶切位点进行全长基因连结并测序鉴定。

八、体外蛋白翻译

体外蛋白翻译用美国Novagen公司试剂盒。在兔网织红细胞裂解液中完成其翻译过程，并用³⁵S标记蛋氨酸参入。将其翻译产物做聚丙烯酰胺凝胶电泳，负压干胶后，作放射自显影。

九、多克隆抗体的制备

根据计算机分析结果，C2的52-69及75-94氨基酸寡肽在美国Thomas Jefferson大学的kimmel Cancer中心合成，合成后的寡肽由Keyhole Limpet hemocyanin (KLH)包被。在分3次在新西兰家兔免疫后的第35 d抽取血清，用ELISA检测抗体滴度。

十、细胞转染

将C2装入细胞内表达载体PcDNA3(美国，Invitrogen公司产品)。离心收集HepG2细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗后，重新种于4 ml培养液中，加入10 μg质粒DNA（PcDNA3-C2），混匀后加入20 μl的SuperFect Reagent(美国，Qiagen公司产品)，混匀，室温下温育10 min。37℃ 3 h后换常规培养液，继续培养48 h，做瞬时基因表达检测，或加入G418（800 μg/ml）后做稳定选择培养。

十一、流式细胞分析(FACS)

离心收集进入对数生长期的经C2 转染的HepG2细胞，溶于PBS，加质量分数为0.95的乙醇固定细胞，于4℃存放数天后作FACS分析。

十二、软琼脂集落形成实验及成瘤性观察

用质量分数为0.004的软琼脂做为底胶，将1×10³用C2稳定转染的HepG2细胞和质量分数为0.002的琼脂混合后种于底胶上，继续培养3 W，观察集落数目。将1×10⁷的用C2稳定转染的HepG2细胞种于裸鼠皮下，6 W后观察肿瘤的大小和数目，以判定转染细胞的成瘤性。

结果

一、HepG2X及HepG2CAT细胞cDNA文库的抑制差减杂交及基因库比较结果

共有8个cDNA片断从HepG2X细胞中克隆，其中5个与基因库已知基因有大于89%的同源性，3个无同源性。在5个有同源性的基因中，3个与胚胎来的组织有部分同源，提示这3个基因可能有促进细胞生长的功能。此外，有2个片断从HepG2CAT细胞中克隆出来，其中一个C2与酵母（yeast）蛋白翻译启始因子（Sui1）同源，另一个无同源性。因此，在HepG2X和HepG2CAT细胞之间，共有10个差示表达基因片断被克隆。

二、Northern Blot分析C2在HepG2X和HepG2CAT细胞中的表达

提取两组细胞等量RNA，做多聚甲醛凝胶电泳及硝酸纤维素膜转印，用³²P标记C2探针，做Northern Blot杂交。C2（来自HepG2CAT的探针）主要表达在HepG2CAT细胞（图1）。

图1A.Northern Blot分析C2 RNA表达显示条带在1.3 kb，且HepG2CAT(1)表达强于HepG2X(2)B.G3PDH内源性对照示HepG2CAT(1)及HepG2X(2)两泳道均加入等量RNA

三、原位分子杂交检测C2在HepG2X,HepG2CAT及临床组织中的表达

用C2探针在HepG2X和HepG2CAT细胞上做原位分子杂交，其结果和Northern Blot一致,来自HepG2CAT的探针（C2）主要表达在HepG2CAT细胞上（图2A、B）。同时我们用原位分子杂交在HBV感染的临床标本上检测了C2的表达情况，结果显示，96%（22/23）正常癌旁肝组织可检测到C2mRNA信号，而肝癌组织仅22%（5/23）弱阳性（P＜0.01）（ 图2C、D）。

四、C2全长基因序列克隆及基因库比较结果

用马拉松全长cDNA扩增技术及末端RACE PCR 得到C2全长基因序列为1.35 kb，编码113个氨基酸（图3），基因库比较和酵母的蛋白翻译起始因子同源。

五、C2全长基因体外蛋白翻译

将C2全长基因装入体外表达载体，在兔网织红细胞裂解液中，将³⁵S-蛋氨酸参入完成其蛋白翻译。放射自显影后，可以看到C2的翻译蛋白在13 000（图4）。

六、C2蛋白质印迹分析（Western Blot）结果

建立PcDNA3-C2,PcDNA3-HBX和PcDNA3 3种细胞内表达载体，分别做HepG2细胞的稳定转染，提取等量蛋白质做Western Blot分析。结果显示C2相对分子质量大约为13 000，转染pcDNA3-C2的细胞表达明显强于转染PcDNA3-HBX和PcDNA3的细胞，其中单纯载体转染的PcDNA3-HepG2细胞的表达介于两者中间（图5）。

七、C2初步功能研究

1.流式细胞分析：将全长基因C2装入细胞内表达载体PcDNA3，进行细胞转染。 在转染后48 h，有32.2%的