第四军医大学学报2000年第21卷第4期

屈延章翔吴景文柴玉波吴元明高大宽

摘要:目的克隆并表达小鼠endostatin基因，并初步检测其血管生长抑制功 能，为胶质瘤的基因治疗探索新的途径.方法从小鼠肝组织用RT-PCR法扩增 endostatin基因，重组入pUC19质粒,经测序证实无误后，重组入表达载体pDH，经温度诱导表达，并用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验检测表达产物活性.结果从小鼠肝组织中成功扩增到endostatin基因，测序与报道序列一致. 重组进pDH后经温度诱导表达，在S dS-PAGE电泳上得到一条新的蛋白表达带，分子质量为20 ku.纯化后的蛋白能明显抑制CAM 的 血管生长.结论成功构建了小鼠endostatin cDNA的重组克隆pDH-Endo，并 在大肠杆菌中获得高效表达. 在CAM实验中表明纯化后的蛋白具 有明显血管抑制作用. 为利用endostatin进行脑胶质瘤等实体瘤的基因治疗奠定了实验基础.

关键词：内皮抑素；反转录-聚合酶链式反应；基因克隆；基因表达；鸡胚绒毛尿囊膜实验

0引言

胶质瘤是危害人类生命的常见肿瘤，临床上虽采取积极的治疗，但疗效不佳，死亡率很高. 近年来，胶质瘤的基因治疗受到高度重视.由于胶质瘤的发生和发展必须依赖大量的血管生成，因此，选择肿瘤血管作为治疗靶，从而抑制肿瘤生长，即可达到治疗胶质瘤目的，此项研究成为近年胶质瘤治疗的热点. Endostatin是O′Reilly等^［1］在 治疗实体瘤研 究中发现的，它具有强烈抑制血管内皮细胞增殖的作用.在小鼠皮下重复注射该重组表达蛋白，在没有毒性或耐药性的情况下几乎完全抑制了该鼠皮下Lewis肺癌、T241纤维肉瘤和B16F10黑色素瘤生长. 作为一种新的血管生成抑制因子，endostatin在脑胶质瘤治疗方面具有广阔前景.

1材料和方法

1.1材料克隆载体pUC19，表达质粒pDH，E.coli dH5α由本校生物化学与 分子生物学教研室提供.限制性内切酶，T4 DNA ligase，Tag DNA聚合酶, RNaseA 等分别购自华美公司、美 国Biolabs公司和Promega公司.测序试剂盒、RNA提取试剂盒和PCR纯化试剂盒分别购自美国 ABI公司、Gibco公司和Clontech公司.其他试剂均为国产. 2只体质量15～20 g的雄性昆明种小白鼠，由本校实验动物中心提供.

1.2方法

1.2.1引物设计与合成根据已知小鼠endostatin基因编码序列，在其两端设计一对引物并在上下游5′端引入EcoRI和SalI酶切位点.

E 1： 5′ ATGAATTCATGCATACTCATCAGGACTTTC 3′

E 2： 5′ ATGTCGACTTATTTGGAGAAAGAGGTCATG 3′

引物由北京赛百盛生物工程公司合成.

1.2.2RT-PCR扩增endostatin基因从小鼠肝组织提取总RNA，反转录获得 cDNA，方法 参照文献［2］. 以所获cDNA为模板，应用引物E1,E2扩增Endostatin基因. PCR反 应条件为94℃ 30 s，58℃ 45 s和72℃ 30 s，循环30次. pCR反应体系为：小鼠肝组织cDNA 模板5 μL，20 pmol·L^-1引物各1μL，10 mmol·L^-1 dNTP 2 μL，10×PCR 反应缓冲液5 μL和Taq dNA 聚 合酶33.34 pmol·S^-1，加水至总体积50 μL.扩增产物用Clontech DNA纯化试剂盒 回收纯化.

1.2.3Endostatin基因的克隆及序列测定纯化的扩增产物和pUC19载体以EcoR i和 SalI双酶切，T4 DNA ligase连接后，转化DH5α中；加入X-gal, IPTG，挑选白色克隆. 碱裂解法小量提取质粒. 用EcoRI和SalI双酶切鉴定. ABI373自动测序仪测定DNA序列.

1.2.4Endostatin原核表达质粒的构建与表达鉴定经测序证实的质粒DNA以 e coRI和SalI双酶切纯化后，与同样处理的pDH经T4 DNA ligase相连接，转化大肠杆菌 dH5 α中,挑选阳性克隆（pDH-endostatin，简称pDH－Endo）.碱裂解法小量提取质粒，用E coRI和SalI双酶切鉴定.阳性克隆重新转接含氨苄青霉素（100 mg·L^-1）的L b中 ，32℃培养至A_{600 nm}≈0.6左右,转入42℃水浴中快速振摇5 h后收菌. 与诱导前 细菌同时进行SDS-PAGE电泳.

1.2.5Endostatin蛋白纯化与鉴定取上述endostatin表达菌种接种于含氨苄青霉素（100 mg·L^-1）1 L LB中诱导，收集菌体用50 mL裂菌液（300 g·L^{- 1}蔗糖、5 g·L^-1 dOC, 100 mmol·L^-1 pH 8.0 NaCl）悬浮，超声裂菌，离心10 000 g 共20 min, 取上清和沉淀,分别作蛋白电泳，确定目的蛋白存在于包涵体中. 沉淀经20 g·L^-1DOC洗涤2遍,2 mol·L^{- 1}Urea洗涤1次，弃上清,加入变性液（ 50 mmol·L^-1 Tris·HCl，2 mmol·L ^-1 eDTA，7 mol·L^-1尿素， 5 g·L^-1β-巯基乙醇， pH=8.0 ）室温放置 3 h以上, 离心去沉淀，测蛋白浓度. 在变性条件下过阳离子交换柱. 将变性蛋白浓度调至0. 5 g·L^-1装入透析袋（截留分子质量8 ku）用50 g·L^-1甘油透析48 h，冷冻 干燥.取样进行SDS-PAGE电泳鉴定.

1.2.6Endostatin表达蛋白活性检测采用CAM实验进行，孵育7 d的受精鸡胚，蛋 壳开1 cm²左右窗口，纯化重组endostatin蛋白加样于灭菌滤纸片上，放置于CAM上，在恒温恒湿培养箱37℃下培养48 h，观察血管生长情况.

2结果

2.1 endostatin基因扩增以小鼠肝脏cDNA为模板，PCR扩增endosta ti n基因，所获扩增产物在15 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳观察，与预期551 bp基本一致（Fi g 1）.

图 1目的基因的PCR扩增

fig 1Amplification of endostatin gene

1: PCR product; 2: PCR marker (DL2000,Takara).

2.2Endostatin重组克隆的酶切鉴定和测序上述基因片段和质粒pUC19经EcoRI和SalI双 酶切、连接后转化DH5α，挑选白色克隆进行同样双酶切鉴定.15 g·L^-1琼脂糖 凝胶电泳 显示：切出大小约551 bp片段. 应用通用引物测序，所获基因序列与文献［3］报道序列完全一致.

2.3pDH-Endo原核表达载体的构建 用EcoRI和 SalI双酶切质粒pUC19-endostatin，琼脂糖凝胶电泳分离，回收551 bp片段；与相同酶切消化的大肠杆菌表达载体pDH连接，转化DH5α. 挑取正确克隆，将其命名为pDH-Endo（Fig 2）.

2.4重组pDH-Endo在大肠杆菌中的表达与纯化pDH-En do重组质粒在E.coli DH5α宿主菌内进行 温度诱导, 作SDS-PAGE，与未诱导pDH/DH5α对照菌株比较，工程菌在分子质量20 ku处出 现 一条明显的新生蛋白带(Fig 3).表达菌体裂解上清和沉淀各部分进行120 g·L^-1SDS-PAGE分析，表明pDH-Endo的表达产物为包涵体.经纯化及复性后，作SDS-PAGE，获纯 度98%以上的目的蛋白(Fig 4).

图 2pDH-Endo重组克隆酶切鉴定

fig 2Restriction mapping of recombinant plasmid pDH-Endo

1: Recombinant plasmid pDH-Endo; 2: pDH plasmid;3: Marker (DL2000,TAKARA).

图 3pDH-Endo重组克隆表达产物蛋白电泳结果

fig 3 SDS-PAGE of expressed endostatin in E.coli DH5α

1: Protein weight marker(MG0041,SABC); 2: Non-induced engineered bacteria with pDH-Endo; 3: Induced engineered bacteria with pDH-Endo.

图 4纯化及复性后的重组内皮抑素电泳结果

fig 4Purification and re-folder of the expression r-endostat ion

1: Non- purification and re-folder; 2: After purification and re-folder.

2.5重组endostatin活性测定0.1～10μg endo statin加样于灭菌滤纸小片，置于孵育7 d鸡胚的CAM上，37℃继续孵育48 h，剥开蛋壳观察 结果，未加endostatin对照组CAM血管呈叶状分布，实验组1μg endostatin即可抑制CAM血 管生长，血管密度明显降低(Fig 5).

图 5CAM实验结果

fig5 CAM assay

a: Non-induced