第四军医大学学报2000年第21卷第6期

马翠玲刘玉峰李志强廖文俊

摘要:目的研究人乳头瘤病毒（HPV）16型E6/E7基因对人角质形成细胞增殖及细胞周期调控因子p53,pRb的影响.方法Lipofectamine 介导法进行转染，筛选阳性克隆，免疫荧光染色检测HPV16E6/E7在转染细胞内的表达；流式细胞仪分析细胞周期变化；免疫印迹分析p53,pRb表达情况.结果免疫荧光染色检测见转染细胞内有HPVE6/E7表达；流式细胞仪显示转染细胞G1期细胞为49.2%比正常角质形成细胞（73.4％）少，S期细胞（39.8％）比未转染细胞（19.4％）增多，免疫印迹分析发现正常角质形成细胞和转染角质形成细胞，均在p53,pRb相应分子量处出现染色带，但转染细胞染色带的着色深度均明显弱于正常细胞.结论HPV16E6/E7能影响细胞的生长和增殖,其作用可能与p53,pRb有关.

关键词:乳头瘤病毒，人；角蛋白细胞；转染；细胞周期

0引言

由于在皮肤、口腔及宫颈鳞癌组织中检测出16型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）,而且将HPV DNA转染人上皮细胞后，细胞可以发生永生化，因此认为HPV在这些肿瘤发生中具有重要意义^［1］. HPV是一种嗜上皮性小DNA病毒，基因组中共有8个开放读框，其中E6/E7开放读框为调节病毒生长的编码区. 已有报道将高危型HPVE6/E7转染人角质形成细胞后，可诱导人角质形成细胞永生化^［2］. 本实验将HPV16E6/E7基因转染人角质形成细胞，并观察了转染细胞细胞周期及其调节因子的变化，以了解HPV16E6/E7基因转染早期对人角质形成细胞增殖及其调控因子 p53 和成视网膜细胞瘤抑癌蛋白 (Retinoblastoma tumor suppressor protein, pRb)的影响.

1材料和方法

1.1材料质粒pLXSN16E6/E7由美国癌症研究中心Hutchinson教授惠赠，该质粒含HPV16E6/E7开放读框，约800 bp; 抗体：鼠抗人p53单抗（Santa）, 鼠抗人pRb单抗（Santa），过氧化物酶标羊抗鼠IgG(Satan),鼠抗HPV16E6、E7单抗、FITC标记羊抗鼠IgG(博士德武汉公司); 质粒提取试剂盒（QiAGEN）；Lipofectamine转染试剂盒（Gibco）；Luminol发光试剂盒（Santa）；Coomassie蛋白定量试剂盒(Pierce)；角质形成细胞无血清培养基K-SFM（Gibco）；G418（Gibco）SABC试剂盒(博士德武汉公司).

1.2方法①pLXSN16E6/E7质粒的鉴定：质粒提取试剂盒提取pLXSN16E6/E7质粒，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，10 g·L^-1琼脂糖电泳进行鉴定. ②角质形成细胞培养：取正常人包皮（本院门诊手术室），消毒后尽量剪去皮下组织，置2.5 g·L^-1dispase中4°C消化过夜、次日分离真表皮，将表皮部分用2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化，分离角质形成细胞,以1×10^3.L^-1接种，K-SFM培养，用第2代细胞进行基因转染.③Lipofectamine介导法基因转染、细胞周期分析、p53及pRb免疫印迹分析，Lipofectamine介导法基因转染主要步骤：无菌玻璃管中配制：溶液A：质粒2 μg溶于100 μL无血清培养基；溶液B：Lipofectamine 15 μL溶于85 μL无血清培养基, 混合溶液A和B，室温放置30 min后，加K-SFM 0.8 mL, 将质粒-Lipofectamine复合物覆盖到细胞表面，培养6 h后终止转染加K-SFM继续培养72 h， G418（0.5 mg·L^-1）对细胞进行筛选，当对照组细胞死亡后，G418改为0.2 mg·L^-1维持筛选2 wk；挑选G418抗性克隆，用 G418抗性细胞及正常人角质形成细胞进行下述实验：细胞爬片间接免疫荧光染色检测16型HPVE6/E7表达情况;细胞周期分析：胰蛋白酶消化转染及未转染角质形成细胞，PBS洗涤后调整细胞浓度至1×10^3.L^-1，预冷至4℃的无水乙醇固定，用流式细胞仪进行细胞周期分析；p53及pRb免疫印迹分析按文献［3］进行：裂解转染及未转染细胞，用Coomassie试剂盒定量裂解物中总蛋白量，取等量（100 μg/孔）待测样品SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜，分别加入鼠抗人p53单抗、兔抗人pRb 多抗，4℃过夜，加入HRP标羊抗鼠IgG孵育后加入Luminol发光试剂,Kodak胶片记录.

2结果

2.1pLXSN16E6/E7质粒酶切鉴定质粒以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，10 g·L^-1琼脂糖电泳可见1条800 bp的目的片断和载体片断（Fig 1），证明所获质粒确为pLXSN16E6/E7.

2.2脂质体介导转染的角质形成细胞克隆形成时，克隆内细胞呈椭圆形及多角形形态，细胞完全融合后形态类似于正常角质形成细胞. 间接免疫荧光染色检测见大多数转染细胞内有胞质绿色荧光,为HPV16E6/E7在转染细胞内表达，正常角质形成细胞未见荧光. 转染的角质形成细胞继续体外培养120 d,传代至22代，仍生长良好，增殖状态稳定，而正常角质形成细胞培养60 d,传代至第10代，大多数细胞角化死亡.

图 1pLXSN16E6/E7质粒酶切鉴定

Fig 1Digestion of PLXN16E6/E7 with EcoRI plus BamHI

P: pLXSN16E6/E7； P₁: pLXSN16E6/E7:EcoRI+BamHI； M: λDNA/HindⅢ Marker.

图 2 p53,pRb在转染(T)与正常(N)角质形成细胞表达的免疫印迹分析

Fig 2 Western blot analysis of p53，pRb expression in transfected keratinocytes(T) and normal control (N)

2.3流式细胞仪检测细胞周期变化转染细胞增殖旺盛,G1期细胞为49.2%比正常角质形成细胞（73.4％）少，S期细胞（39.8％）比未转染细胞（19.4％）增多. G2期细胞为11.8%稍高于对照组（7.2％）.

2.4p53,pRb免疫印迹分析免疫印迹分析发现正常角质形成细胞和转染角质形成细胞均在p53,pRb相应分子质量(M_r53 000,M_r 110 000)处出现染色带，但转染细胞p53染色带的着色深度明显弱于正常细胞，即正常角质形成细胞与转染细胞p53,pRb均有表达，转染细胞p53,pRb表达减少(Fig 2).

3讨论

近年来，通过细胞转化技术建立体外培养较为困难的人体组织细胞系，大大推动了在细胞分子水平上对人类生物学以及疾病发病机制的研究，在众多用于转化细胞的物质中，HPVE6/E7是研究较多的基因. HPVE6/E7介导的作用包括细胞永生化、转化、肿瘤形成和凋亡等. 永生化被认为是发展为完全恶性的一个步骤^［4,5］,我们利用HPV16E6/E7转染人角质形成细胞，G418筛选获得表达HPV16E6/ E7的转染细胞在体外生长时间明显延长，培养120 d，仍保持稳定增殖状态，趋于永生化. 而未转染细胞培养60 d大部分角化死亡. 对该转染细胞的进一步研究将有助于了解16型HPV所致疾病及肿瘤的发生特性及规律.

流式细胞仪结果显示，HPV16E6/E7转染的人角质形成细胞G1期细胞为49.2%比正常角质形成细胞（73.4％）少，而S期细胞（39.8％）增多是未转染细胞（19.4％）的2倍，很明显，HPV16E6/E7可以影响细胞的生长和增殖，转染细胞增生活跃.

正常生长的机体细胞处于一种增殖与抑制增殖的动态平衡之中，促增殖因子的过度表达与抑制增殖成分的缺失都会导致细胞增殖失控进而引起细胞永生化和肿瘤的发生. p53和pRb是研究较多的抑癌蛋白. 大约50％的人类肿瘤与p53有关，Rb基因的缺失和突变也与多种肿瘤的发生有密切关系，其编码的蛋白pRb处于细胞调控的中心环节：一方面它在控制细胞进入生长分裂周期及脱离细胞周期而进入分化状态的过程中起重要作用，另一方面又受到细胞内外各种信号的调控，以保证其功能与细胞生长、分化状态相适应^［6-8］.

我们对转染细胞p53,pRb表达的免疫印迹分析显示，HPV16E6/E7转染的人角质形成细胞早期出现p53,pRb 表达水平降低，与Pei等^［6］结果一致，表明p53,pRb在HPVE6/E7介导的永生化过程中起重要作用，与转染细胞分化失控，细胞增殖旺盛有关^［9,10］. pRb表达水平的降低还在HPVE7转化的乳房上皮细胞、人成纤维细胞等细胞中观察到，与E7的表达密切相关^［6-8］. 可能与转化细胞抵抗生长休止信号的调控有关.

总之，HPV16E6/E7转染人角质形成细胞可以引起细胞增殖周期的紊乱，增殖活力增强,体外培养时间明显延长，其作用可能与抑癌蛋白p53,pRb有关.

基金项目：国家自然科学基金资助项目（39570656）

作者简介：马翠玲(1963),女（汉族）,河南省开封市人. 博士生（导师刘玉峰）,主治医师,讲师. Tel.(029)3373861 Email.macuiling@21cn.com

马翠玲（第四军医大学西医院皮肤科，陕西 西安 710033）

刘玉峰（第四军医大学西医院皮肤科，陕西 西安 710033）

李志强（第三军医大学西南医院皮肤科）

廖文俊（第四军医大学西医院皮肤科，陕西 西安 71003