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师长宏施阳施新猷朱德生李六金
摘要:目的建立一株肝癌细胞系HCC-9724，为肝癌研究提供实验模型.方法无菌切除肝癌手术标本，6只裸鼠右后肢皮下包埋，体内连续传3代后，取移植瘤体外培养，绘制细胞生长曲线，光镜、电镜观察细胞形态，并进行细胞周期和染色体核形分析，用免疫荧光法测定荷瘤鼠中AFP的表达.结果移植模型原代获得率为33.3%，潜伏期为52 d，自第3代后肿瘤获得率为100.0%，潜伏期为16 d，该模型移植瘤具有生长稳定，移植成功率高（100%），潜伏期短(10 d)，无自发消退等特点，裸鼠移植瘤标本体外培养得到肝癌细胞系HCC-9724(简称H)，其形态结构，排列方式和移植瘤的分化程度与原发瘤保持一致，且遗传学特性包括染色体形态仍为人类核型，众数维持在62～66之间，占75.0%，细胞周期分析G1期53.5%，G2期19.5%，S1期27.0%，细胞群体倍增时间为23 d，建立的裸小鼠人肝癌模型具有典型的肝细胞癌特征，持续分泌甲胎蛋白（AFP）.结论通过裸鼠体内移植瘤建立的肝癌细胞系HCC-9724，与原发癌保持相同的生物学特性，体外连续传代6 mo以上，细胞形态不变，生长周期恒定，可望作为一个稳定的细胞系.
关键词：细胞培养；裸鼠；细胞系；肝细胞癌
0引言
裸鼠是在人体外进行肝癌整体研究的理想实验工具，自1960年陈瑞铭应用组织培养技术，首次成功地建立了第一例人肝癌细胞系以来，迄今国内外已建立了23株人体肝癌细胞系［1］，均采用组织块直接培养法,为肝癌的防治研究提供了理想的实验模型，但此种建株方法，对标本要求严格，带有很大的偶然性,由于肿瘤的异质性和复杂性［2］，随着体外传代次数的增多，瘤细胞的特性会发生较大的改变,需不断建立肝癌细胞系,对其做进一步的深入研究.
1材料和方法
1.1实验动物BALB/c-nu/nu裸鼠，由北京生物药品鉴定所提供，鼠龄为4～5 wk，雌雄兼用，其实验和饲养均在SPF条件下的超净层流架中进行，灭菌处理的水和饲料供动物自由摄入.
1.2主要试剂培养基：RPMI-1640 (Gibco)，胎牛血清(FBS)(浙江金华生物制剂厂生产)，胰酶(Sigma公司)，HEPES(Gibco)，AFP-RIA(上海生物制品研究所)，羊抗兔γ-球蛋白抗体（异硫氰酸荧光素标记）(华美公司).
1.3癌组织材料HCC-9724肝癌组织是取自1997-09-22西京医院普一科手术切除的标本，男,58岁，患者右上腹部痛2 mo. B超显示右肝6.9 cm×5.8 cm×3.7 cm瘤块,AFP＞400 μg*L-1, 病理诊断为肝细胞癌三级.肝癌组织标本离体后进行培养，在无菌条件下去除包膜，清除标本周围的纤维组织及坏死部分，用含双抗的1640 反复冲洗后，取新鲜的癌组织用弯剪刀剪成约1 mm3组织碎块.
1.4细胞培养取2～3块1 mm3新鲜的肝癌标本，包埋于裸鼠右后肢皮下，手术缝合，置SPF 条件中饲养观察，裸鼠皮下连续传代3次后,形成的组织块进行培养，得到大量上皮样肿瘤细胞，用0.2 g*L-1EDTA-1.25 g*L-1胰酶消化，体外传代，细胞长至F6代时进行冻存，并进行指标检测，记做HCC-9724.
1.5 细胞形态特征［3］ 癌组织石蜡包埋切片HE染色，培养细胞用倒置显微镜观察，收集对数生长期细胞，0.01 mol的PBS洗两次，2000 r*min-1离心10min收集细胞，弃上清以40 mL*L-1pH7.4的戊二醛固定后，按电镜标本常规制备法，进行固定，包埋，超薄切片，铅-铀染色，JEM-2000型透射电镜观察.
1.6细胞生长特征按文献［3］方法进行. 调整HCC-9724细胞浓度,按1×104接种于24 孔板， 置37℃50 mL*L-1 CO2孵箱培养,每个样品重复3孔,计数连续8 d，以培养时间为横坐标，细胞数的对数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线. 取对数生长的HCC-9724细胞，用1.25 g*L-1胰酶-0.2 g*L-1EDTA溶液联合消化细胞，收集单细胞悬液， 1000 r*min-1离心5 min弃上清，重悬浮于5 mL 4℃预冷的PBS中,缓慢加入4℃预冷的950 mL*L-1乙醇15 mL，使终浓度为75 mL*L-1,冰浴30 min流式细胞仪检测.
1.7染色体分析取培养48 h的HCC-9724细胞(100 mL培养瓶)加入秋水仙素工作液(秋水仙素1 mL 1 g*L-1＋H2 0.9 mL) 3滴(用5号针头滴加)，至终浓度为0.02 g*L-1,继续培养4 h，收集细胞， 1000 r*min-1离心10 min，低渗固定，空气干燥制片后Giemsa染色，镜检50个中期的分裂相进行染色体分析.
1.8肿瘤生长曲线测定移植完成后，逐日观察移植部位有无感染，肿瘤生长后有无自然消退，每周测量肿瘤长径a和短径b，按公式W(瘤重)=(a×b2)/2计算肿瘤重量，绘制肿瘤生长曲线.
1.9肿瘤标志物测定按文献［4］法进行，对荷瘤裸鼠行眼静脉丛采血，同时收集培养细胞上清液，采用放射免疫( RIA)法测定其中AFP浓度. 处于对数生长期的细胞，消化后，用PBS洗涤1000 r*min-1共5 min,重复两次，滴片，室温晾干后，冷丙酮固定3次，每次15 min，用抗人AFP抗血清及异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔γ-球蛋白抗体温育处理1 h，PBS洗涤，Evans蓝染色，在荧光显微镜下观察.
2结果
2.1癌组织原代培养及传代包埋组织块的裸鼠首先出现局部红肿，25 d 时包块逐渐被吸收，长至52 d后，发现一只裸鼠右后肢皮下长出约0.4 cm×0.8 cm 结节状肿瘤(Fig 1). 手术取出其部分瘤体标本剪碎包膜修成1 mm3的碎块. 按上述方法移植传代3次后，再行组织块培养. 5 d时组织块周围，开始有上皮样细胞向外生长,且长势较快,有的部位呈克隆性生长,很快聚集成团;17 d后在25 mL培养瓶中长满上皮样细胞 (Fig 2,3)，用0.2 g*L-1EDTA-1.25 g*L-1胰酶消化，反复贴壁，很容易就去除成纤维细胞，每周传代1～2次，开始1∶2 稀释传代，后来以1∶4稀释传代，血清量始终为150 mL*L-1，细胞生长良好.
2.2细胞形态特征光镜观察：体外培养的细胞为多角形，核仁大可见分裂相，在相差显微镜下（Fig 3），细胞形态呈上皮样排列，生长的单层细胞有重叠生长能力，细胞呈圆形或椭圆形，核大，胞质深染，且相对较少,核仁1～2 个，细胞异型性明显，核丝分裂偶见,细胞呈弥漫分布，组织像属恶性肿瘤. 电镜观察（Fig 4）：体外培养的F6 HCC-9724细胞，细胞核大而有异形性，核仁明显，染色质分散，稍聚于核膜，胞质较少，含有较多的线粒体，溶酶体、线粒体肿大并增多，少量的粗面内质网，胞质内有丰富的游离核糖体，细胞间排列紧密，显示出肝细胞肝癌的形态学特征.
2.3细胞生长曲线如Fig 5所示.
图 5人肝癌细胞系HCC-9724细胞生长曲线
Fig 5Growth curve of HCC-9724 cell
2.4细胞生长周期流式细胞仪测得的细胞生长状况G1=53.5, G2=19.5,G2/G1=1.873, 为亚三倍体细胞，细胞周期符合肿瘤细胞特点.
2.5染色体分析 移植瘤连续传代后，染色体仍保持人类肿瘤染色体的特点(Fig 6)， 细胞染色体众数(M)集中在62～66之间，占75.0%，存在多数中央及亚中央着丝粒染色体，而裸鼠的染色体数2n=40，且均为顶端着丝，据此可与人类染色体相区别. 在传代过程中染色体众数变化较大，提示肿瘤细胞可能向更加恶性型发展.
2.6移植瘤传代特性移植瘤皮下连续传代后，潜伏期由原代的52 d逐渐缩短并稳定在15 d左右，肿瘤的外观为圆形实体瘤，随着肿瘤体积增大被覆肿瘤的皮肤血管扩张，移植瘤生长后无自然消退，移植瘤与患者肝癌细胞相比，细胞形态基本一致，但移植瘤细胞变小，间质成分明显减少（Fig 7,8）. 自第2代后移植瘤传代成功率均为100.0%，F6代肿瘤细胞按106(0.2 mL) 接种裸鼠右后肢皮下，10 d后即可成瘤如Tab 1所示.
图 1原代移植荷瘤小鼠
Fig 1Visible tumor manifested in nude mice after SC inoculation×200
图 2培养5 d，组织块周围有上皮样细胞游出
Fig 2Epithelioid cell grow around tissue after culturing 5 days×200
