第四军医大学学报2000年第21卷第5期

吴元明张俊杰纪宗玲刘惠萍陈南春陈苏民

摘要: 目的克隆人的era基因（简称Hera）并利用大肠杆菌进行表达.方法PCR扩增Hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEX-4T3，受控于Ptac启动子,重组质粒pGEX-Hera以大肠杆菌DH5α为宿主菌,用IPTG进行诱导表达.结果克隆了Hera基因, 测序正确；含重组质粒pGEX-Hera的菌体诱导后在SDS-PAGE上出现一条新生蛋白带，相对分子质量为65 ku,占菌体总蛋白的23%.结论成功扩增、克隆Hera基因，并在大肠杆菌中得到高效表达.

关键词：人era；基因克隆；序列测定；基因表达；大肠杆菌

0引言

era是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseⅢ的rnc基因下游发现的一个开放读框，因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为E.coli ras-like(era)基因^［1］. era是细菌生存繁殖所必需的基因^［2］. 以往认为era只是细菌中的基因，随着“基因组计划”研究的进展，发现在C. elegans、小鼠及人中存在与该序列高度同源的真核表达序列标签^［2］.我们根据与细菌era序列同源的人EST已成功地克隆了全长Hera-cDNA基因（Genebank收录号 AF082657）. Era和细菌的细胞周期调控以及蛋白质的合成有关.但有关人的Era方面的研究至今还未见报道. 为了研究Hera的理化特性，进一步了解其功能，我们开展了以下基础性的工作.

1材料和方法

1.1材料大肠杆菌DH5α菌种，pUC19质粒均为本教研室保存；表达质粒pGEX-4T3为Pharmacia公司产品. pBS-Hera为陈苏民教授提供.各种限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶 均为Gibco公司产品. dNA marker和蛋白marker为Takara公司产品.柱式质粒纯化试剂盒为华舜公司产品.

1．2方法PCR引物: 正向： 5-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG,反向： 5-AACTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC. PCR反应以pBS-Hera为模板在PE公司9600反应仪上进行.循环参数为96℃ 30 s; 60℃ 50 s; 72℃ 40 s; 30个循环. 纯化的PCR产物用BamHI和PstI双酶切定向克隆入pUC19质粒，转化E.coli jM109,进行蓝白筛选，并经酶切鉴定筛选出含插入片段的阳性克隆.核苷酸序列分析利用PE公司310型测序仪进行序列测定. Hera基因与表达载体的重组,细菌转化及阳性克隆筛选按参考文献［3］进行.目的蛋白的诱导表达：工程菌在含氨苄青霉素（100 mg*L^-1）的LB培养液中32℃振荡过夜，次日按4%转接扩大培养，继续在32℃振荡2～4 h，当A₆₀₀=0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol*L^-1进行化学诱导表达. sDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：4℃ 9000 g离心5 min收集菌体，用含3 mL*L^-1巯基乙醇加样缓冲液处理（100℃， 10 min）， 12000 g离心10 min，采用Laemmli不连续PAGE，150 g*L^-1分离胶，考马斯亮蓝R-250染色.

2结果

2．1Hera基因的扩增经PCR扩增获得Hera基因片段，大小与理论值相符（Fig1）.

图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

fig 1Electrophoretic analysis of PCR products in agrose gel

a： DNA Marker DL2000; B： Amplification of Hera.

2．2扩增片段的克隆与鉴定Hera基因片段与pUC19的重组质粒经转化后，从培养板上随机挑选5个白色克隆，质粒经BamHI和PstI双酶切鉴定，都含有插入片段.酶切鉴定结果见Fig 2.

图2重组pUC19-Hera质粒经BamHI和PstI酶切鉴定

fig 2Restriction mapping of recombinant plasmid pUC19-Hera with BamHI plus pstI

a: Recombinant plasmid pUC19-Hera digested with BamHI plus PstI; B: Recombinant plasmid pUC19-Hera; C: pUC19; D: λDNA/HindⅢ marker.

2．3核苷酸序列测定挑选一个含插入片段的阳性克隆命名为pUC19-Hera,以pUC19通用测序引物进行序列测定.测序结果表明，所扩增的Hera基因与已知序列完全相符.

2．4pGEX-Hera表达质粒的构建用PstI酶切pUC19-Hera，Klenow补平，再用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳后，回收1038 bp目的片段；亚克隆入经BamHI和SmaI双酶切的pGEX-4T3载体，用氯化钙法转化DH5α感受态，用酶切鉴定法挑取克隆，将正确的阳性克隆命名pGEX-Hera.酶切鉴定结果见Fig 3.

图3重组质粒pGEX-Hera经BamHI和NotI酶切鉴定

fig 3Restriction mapping of recombinant plasmid pGEX-Hera with BamHI plus notI

a: Recombinant plasmid pGEX-Hera digested with BamHI plus NotI; B: Recombinant plasmid pGEX-Hera; C: pGEX-4T3; D: λDNA/HindⅢ marker.

2．5重组pGEX-Hera在大肠杆菌中的表达pGEX-Hera重组质粒进行化学诱导，收菌，经还原处理后作SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，与空白对照菌株比较，含pGEX-Hera的菌株在M_r65000处出现一条明显的新生蛋白带(Fig 4)，其含量随诱导时间的延长而增加，4～5 h最高，以后趋于稳定(Fig 5). 经5 h诱导后电泳薄层扫描显示新表达条带约占菌体总蛋白的23%.

图4重组Hera诱导表达后的SDS-PAGE结果

fig 4SDS-PAGE of expressed Hera in E.coli

a: Protein molecular weight marker B: Non-induced bacteria with pGEX-4T3; C: induced bacteria with pGEX-4T3; D: Non-induced bacteria with pGEX-Hera; E: induced bacteria with pGEX-Hera.

3讨论

era是在细菌中能正常表达的基因，尽管其表达水平极低，但era基因缺失细菌就不能生存.当Era功能减弱时，细菌的DNA虽能复制、子代DNA能分离，但细胞不能分裂，停滞在胞核分离和胞质分离之间，证明Era功能与细菌细胞分裂相关^［2］.

era是从细菌到人高度保守的G蛋白基因, 人Era蛋白与大肠杆菌Era蛋白的氨基酸序列有30%相同，两者的相似性为53%^［2］. era基因的N端含有4个鸟苷酸结合区（G1，G2，G3，G4）.高表达的Era蛋白特性显示：Era是一种G蛋白，能特异地与鸟苷酸结合，并具有GTP酶的活性^［4］. era基因的C端也相当保守，且含有一个能与此同时RNA特异结合的KH domain^［5］. 体外实验证明Era能与16sRNA结合，但RNA结合与GTP酶活性之间的关系还不清楚^［6］.总之，era是一种有别于Ras的小G蛋白家族的新成员.

图5重组Hera不同时间诱导表达后的SDS-PAGE结果

fig 5SDS-PAGE of expressed Hera after the bacteria has been induced for different time

a: Protein molecular mass marker; B: Non-induced bacteria with pGEX-Hera; C～H: induced bacteria with pGEX-Hera from 1 to 6 h.

本研究通过基因重组的手段，利用GST融合表达载体在大肠杆菌高表达了Hera基因.这就为Era的纯化、特性分析、抗体制备打下了基础.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870380，39670006);全军医药卫生科研基金资助项目(98M108)

作者简介：吴元明(1972-)， 男(汉族)，安徽省东至县人. 硕士, 助教. Tel.（029）3374516 Ext.13Email. wuyuanming@usa.net吴元明（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安 710033)

张俊杰（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安 710033)

纪宗玲（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安 710033)

刘惠萍（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安 710033)

陈南春（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安 710033)

陈苏民（第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安 710033）

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