第四军医大学学报2000年第21卷第4期

刘家云于文彬马越云范金水丁振若苏明权陈云春

摘要: 目的构建人杀菌/通透性增加蛋白（BPI）N端活性片段cDNA序列的 真核表达载体 并了解其在COS-7细胞中的表达.方法提取人外周血多形核白细胞（PMN）总 RNA进行逆转 录反应，经套式PCR扩增出BPI N端基因片段，将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序 列测定，然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI；重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞，免疫荧光法鉴定BPI的表达.结果酶切鉴定和序列分析证实重组 质粒含有包括 信号肽在内的BPI活性片段编码序列，转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性 的 BPI片段.结论BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功，为下一步BPI功能 的研究奠定了基础.

关键词：杀菌/通透性增加蛋白；逆转录PCR；序列分析；基因重组；真核表达

0引言

1978年Weiss等^［1］从健康和慢性粒细胞白血病患者的多型核白细胞(polymorphon uclear neutrophils, PMN)中提取得到一种表观分子量为55 U，等电点为pH 9.8的蛋白质 ，因其对数株大肠埃希氏菌、伤寒沙门氏菌具有杀伤作用，并且能立即增加敏感细菌细胞壁 的通透性，使得正常情况下不能通过细胞壁的放线菌素D得以穿过细胞壁而进入菌体，因而 称之为杀菌通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI）. B PI是456 个氨基酸组成的阳离子蛋白，对革兰氏阴性菌具有强力的杀菌作用和中和内毒素功 能，尤为 值得注意的是BPI N端活性片段与BPI具有相似的生物学功能，二者均和革兰氏阴性菌脂多糖 (l ipopolysaccharide，LPS)具有较高的亲和力，同后者结合所形成的BPI-LPS复合物能抑制L PS的炎性级联信号向CD14的传导，从而阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应^［2］ . 此外， 越来越多的研究表明，BPI在抗真菌感染^［3］、抗弓形虫感染^［4］等方面也 具有重要的意义， 并且在儿科重症脑膜炎血症、部分肝切除、出血性创伤、重症腹膜感染以及囊性纤维化等多 种疾病的治疗方面显示出良好的应用前景^［5］. 为了获取大量的BPI重组蛋白，以深入研究BPI的生物学功能，探讨其杀菌和中和内毒素作用 机制，本文从人外周血中提取PMN 总RNA，经RT-PCR获得BPI cDNA，构建了BPI真核表达载 体，并对其在COS-7细胞中的表达产物进行了鉴定.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、质粒及细胞系E.col i JM109，pUC19为本室保存，pcDNA3含CMV 早期启动子 和新霉素(Neomycin)抗性基因；COS-7细胞系由本校病理学教研室邢金良硕士惠赠 ，其培养基为DMEM完全培养基，含100 mL·L^-1小牛血清.

1.1.2酶及其他试剂PWO DNA polymerase，T4 DNA ligase购自Boehringer公 司；Reverse Transcription System，BamHⅠ，XbaⅠ，XgaⅠ，IPTG和Wizard ^○R Plus Mini preps DNA Purification System,均购自Promega公司；核酸的凝胶纯化试剂盒NucleoTrap^○R Nucleic Acid Purification Kits and Accessories,购自Clontech公司 ；Pol ymorphprep^TM PMN分离液,购自Nycomed Pharmas 公司；RNA提取试剂Trizol Reagent ，脂质体转染试剂Lipofecta mine Reagent，DMEM购自Gibco公司；BPI单克隆抗体为HBT公司产品；荧光抗体羊抗鼠IgG- FITC购自华美公司；小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所.

1.2方法

1.2.1质粒提取、酶切、连接及转化 主要方法均参照文献［6］进行.

1.2.2PCR引物的设计与合成运用计算机软件辅助分析，根据BPI 主要的活性 片段N端序列 ，设计两套引物采用套式PCR扩增目的基因，其中外引物P1，P2扩增BPI cDNA第7-840 bp， 内引物P3，P4扩增BPI cDNA第25-749 bp，并在引物P3，P4分别引入酶切位点BamHⅠ和 XbaⅠ，引物由上海生工生物工程公司合成. 引物设计见Fig 1.

图 1BPI N端序列及引物的设计

Fig 1Sequence of cDNA encoding N-terminal fragment of BPI and prime rs

□labelled sequence: Primers; underlined sequence: Signal pept ide

1.2.3PMN提取收集PMN ＞80%的临床检验用EDTA抗凝血15 mL，取50 m L离心管加入等量Polymorphprep^TM分离液，小心地将全部抗凝血加至分离液层面上 ，室温 下400～450 g离心40 min，轻轻吸出PMN并稀释于等体积的4.5 g·L^-1 NaCl溶液 ，PMN细胞悬液再用生理盐水洗涤3次，每次400 g，10 min，记数PMN细胞数.

1.2.4细胞总RNA的提取 参照Trizol Reagent Kit中的说明书进行;于1.5 mL离心管中加入(5～10)×10⁶ PMN，取1 mL Trizol试剂加于管中反复吹打，待核蛋 白 完全溶解；室温下静置5 min，加0.2 mL三氯甲烷，用力振荡15 s，室温下静置2～3 min，4 ℃，11 000 g离心15 min；吸出上清，加0.5 mL异丙醇，室温下静置10 min，4℃ ，11 000 g离心10 min；弃上清，加1 mL 750 mL·L^-1乙醇，4℃，7000 g 离心10 min；弃上清，室 温干燥5～10 min，加20 μL无RNase水溶解，并置55℃水浴10 min，取2 μL用于反转录.

1.2.5cDNA第一链合成在20 μL反应体积中, 含有10 μg RNA, 10×Buffer 2 μL, 10 mmol·L^-1 dNTP混合液2 μL, 逆转录酶15 U, 引物P2 1 μL, 于42℃水 浴反应1 h，99℃ 5 min灭活逆转录酶后置-20℃备用.

1.2.6PCR扩增BPI cDNA片段首先以反转录产物为模板进行第一轮PCR扩增, 所用引物为P1及P2, 反应体积为50 μL, 反应条件为: 94℃, 2 min; 94℃, 30 s, 55 ℃, 4 5 s, 72℃, 50 s，10×; 94℃, 30 s, 55℃, 45 s, 72℃, 60 s，10×；94℃, 30 s, 55 ℃, 45 s, 72℃, 70 s，10×；94℃, 30 s, 55℃, 45 s, 72℃, 80 s，5×；72℃, 7 min ; 共进行35个循环. 之后以第 一轮PCR扩增产物为模板进行第2轮PCR扩增, 所用引物为P3及P4，反应体积为50 μL, 反应 条 件为: 94℃, 2 min；94℃，30 s，60℃，45 s，72℃，60 s，5×；94℃，30 s，65℃，45 s， 72℃, 60 s，10×；94℃；30 s，65℃，45 s，72℃，70 s，10×；94℃，30 s，65℃, 45 s，72℃, 80 s，10×；72℃, 7 min; 共进行35个循环.

1.2.7BPI基因克隆将第2轮PCR产物及pUC19载体分别经BamHⅠ，Xba Ⅰ双酶切，按DNA与载 体3∶1比例于14℃连接过夜. 取上述连接产物2 μL转化感受态细胞JM109, 将转化后的JM10 9涂布于含100 mg·L^-1氨苄青霉素及X-gal，IPTG的LB平板上, 37℃培养. 16 h后挑 取白色菌落 ，提取质粒, 经BamHⅠ，XbaⅠ双酶切鉴定.

1.2.8DNA序列测定、核苷酸序列分析比较DNA序列测定采用PE公司310型自动 DNA测序仪完成；核苷酸序列分析比较利用网络Entrez Databases及Goldkey软件完成.

1.2.9真核表达载体的构建将测序正确的重组pUC19-BPI提取质粒, 双酶切回收BPI片段, 与预先经BamHⅠ和XbaⅠ双酶切的pcDNA3载体进行连接反应. 以连接反应液转化感 受态JM109, 挑选10个氨苄青霉素抗性的菌落, 小量法提取质粒, 进行酶切鉴定.

1.2.10Lipofectamine法转染COS-7细胞于6孔培养板中加入对数生 长期的COS-7细胞3×10⁵/孔，每孔2 mL DMEM完全培养基，使75％长满. 实验前, 预先配 制Lipofectamine/DNA混合溶液，A液（100 μL无血清DMEM培养基+质粒DNA 2 μg），B液 （100 μL无血清DMEM培养基+10 μL Lipofectamine），将A，B两液混合，置室温下孵育30 min，使其形成DNA-Liposome复合物，再加入800 μL不含血清的DMEM配成Lipofectamine/ DNA混合溶液. 轻轻混匀上述混合溶液并滴加到漂洗过的细胞中，37℃，50 mL·L^-1 CO₂培养6 h，6 h后加入1 mL 含200 mL·L^-1 小牛血清的 DMEM培养基，转染20 h后吸弃培养液换为DMEM完全培养基，72 h后收集细胞进 行检测.

1.2.11活细胞免疫荧光法鉴定BPI的表达转染72 h后，胰蛋白酶消化并收集C OS-7细胞， 用DMEM完全培养基调整细胞为5×10⁶～1×10^7.mL^-1；取40 μL细胞悬液加入预 先有BPI M cAb 10 μL的5 mL离心管，再加50 μL 1∶20稀释的灭活正常兔血清，4℃孵育30 min，洗 涤液洗涤2次 ，2 mL/次，1000 r·min^-1离心5 min；弃上清，加50 μL工作浓度的羊抗鼠Ig-FI TC荧光二抗，充 分振荡，4℃孵育30 min，洗涤液洗涤2次，2 mL/次，1000 r·min^-1离心5 min；加 固定液100 μL，制片后荧光显微镜下观察.

2结果

2.1RNA的完整性及纯度从人PMN中提取的总RNA经电泳，可见明显的28 ，18和5 s条带，且28 s的亮度大约是18 s的2倍，说明所提取的总RNA基本没有降解， 有较 好的完整性. 对RNA样品进行紫外分光光度分析得出D(260)/D(280)＞1.8，表明RNA具有较高 的纯度，符合反