第四军医大学学报2000年第21卷第4期

武国军郝晓柯白玉杰张盈华王禾药立波季少平李福洋

摘要:目的构建抗前列腺特异抗原(PSA)单链抗体（scFv）/人羧肽酶A（hCPA） 融合 基因，为前列腺癌的抗体导向酶-前体药物疗法奠定基础.方法在已克隆抗 PSA scFv和hCPA基因的基础上，用加端PCR分别在scFv基因的3′端和hCPA基因的5′端加上部分连接肽（lin ker）基因序列，回收后混合；应用重叠延伸拼接法，将抗PSA scFv基因和hCPA基因 通过linker序列串联为scFv/hCPA融合基因；并将构建的融合基因克隆到融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达.结果序列测定结果表明，构建的抗PSA scFv/hCPA 融合基因中 scFv和hCPA序列均正确，scFv和hCPA间有18 bp的linker序列，推导的氨基酸序列为GSGGSG ，与设计的序列相符.融合基因经IPTG诱导表达重组蛋白并以SDS-PAGE分析，在Mr为9 4000 左右出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的34%.结论成功构建并原核表达了抗PSA scFv/hCPA融合基因.

关键词：单链抗体；羧肽酶A；融合基因；前列腺肿瘤

0引言

抗体导向酶-前体药物疗法(antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT )目 前已有部分方案用于体内试验.抗体和酶的异源性一直是限制其临床应用的主要问题，有效地解决方法是制备人源化抗体和人源性酶的融合蛋白^［1］.我室合成的前体药物氨 甲喋呤-α-苯丙氨酸(MTX-α-Phe)经羧肽酶A(CPA) 水解后, MTX-α-Phe转化为MTX, 其细胞毒活性大 于前体药物100倍以上，用于前列腺癌动物模型的体内实验，抑瘤率达87.6%.我们在已构 建抗前列腺特异抗原(prostate specific antigen,PSA)scFv基因和克隆了hCPA基因的基础上^［2，3］，利用加端PCR和重叠延伸拼 接法构建了抗人精浆蛋白scFv / hCPA融合基因，并且对该融合基因进行了原核表达和活性测定.

1材料和方法

1．1材料抗PSA scFv重组质粒由本室制备并保存；pUC19质粒和pG eX-4T-1表达 载体引自本校生物化学教研室；反转录试剂盒（Reverse transcription System）、质粒 提取纯化试剂盒（Wizard^TM plus Minipreps DNA Purification System ）、Taq DNA聚合酶及限制性内切酶购自美国Promega公司；快速连接试剂盒（Rapid ligation Kit）为Boe hringer Mannheim公司产品；其余试剂均为国产分析纯.

1．2方法根据抗PSA scFv基因、hCPA基因及连接肽（linker） 的核苷酸序列^［4］，结合引物设计原则，设计并合成了用于scFv基因、hCPA基因扩 增和拼接的引物. 引 物在北京赛白盛(美国)生物工程公司合成.序列如下：

(下划线部分是互补的部分linker核苷酸序列)

分别对scFv基因、hCPA 基因进行加端PCR反应，产物用重叠延伸拼接法（gene splicing by overlap extension,SOE）^［5］重组为抗PSA scFv/hCPA融 合基因（Fig 1）. 反应条件为：94℃变性 1 min, 50℃退火1 min,72℃延坤1.5 min，循环 次数为30～35次.

1.2.1抗PSA scFv/hCPA融合基因的克隆和序列分析回收拼接反应产物，用EcoRI, SalI双酶切，然后与同样酶切开的质粒pUC19连接，转化JM109宿主菌，筛选阳性克隆 . 培养含有scFv/hCPA融合基因的阳性菌株,用Wizard^TM plus Minipreps DNA Purifi ca tion System (Promega,USA)提取重组质粒,用全自动荧光DNA测序仪(美国PE373-A型测序 仪)测定DNA序列. 将scFv/hCPA融合基因的序列输入计算机,用PC/Gene软件将scFv/hCPA基因与已知的scFv 和 hCPA基因进行核苷酸的同源性比较,并推导scFv/hCPA基因编码的氨基酸序列.

1.2.2抗PSA scFv/hCPA融合基因的表达将已测序抗PSA scFv / h CPA融合基因克隆入pGEX-4T-1载体，转化感受态的E.coli. JM109，用终浓度为0.1 mmol·L^-1的IPT g诱导表达5 h. 诱导表达的重组蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳.用岛津公司Dual-wav elength Flying-Spot Scanner CS-9000薄层扫描仪，扫描SDS-PAGE后的蛋白条带.

图 1scFv / hCPA融合基因的构建

fig 1Construction of scFv/hCPA fusion gene

2结果

2．1加端PCR及重叠延伸反应SOE反应的机制如Fig1所示. 对 scFv基因、hCPA 基因分 别进行加端PCR反应，在scFv基因的3′端和hCPA基因的5′端引入互补的核苷酸序列. 然后 ， 将上述两种PCR产物混合，用SOE反应将二者连接为抗PSA scFv / hCPA融合基因. 经1 5 g.L^-1琼脂糖凝胶电泳分析，scFv / hCPA融合基因全长约2000 bp（Fig 2）.

图 2PCR及重叠延伸产物的琼脂糖凝胶电泳

fig 2Gel electrophoresis of PCR and SOE products

1: PCR products of scFv; 2: PCR products of hCPA; 3: SOE products of scFv /hCPA; m: λDNA/EcoRI+Hind Ⅲ Markers (21 227，5148，4268，2027，1584，1375，947，831，564)

2．2抗PSA scFv/hCPA融合基因的序列分析选取一株酶切鉴定正确的克隆， 用全自动荧光DNA测序仪测定序列（Fig 3）.序列分析结果表明：scFv，hCPA序列与发表的 一致，scFv/hCPA融合基因的两侧有预先设计的EcoRI和SalI酶切位点及起始码和终止码. ScFv和hCPA之间有18 bp的Linker序列，其氨基酸序列为GSGGSG.

图 3scFv/hCPA融合基因的核苷酸序列

fig 3The nuclear acid sequence of scFv/hCPA fusion gene

2. 3抗PSA scFv/hCPA融合蛋白的表达及活性鉴定诱导表达的GST scFv/hC PA融合蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见一条Mr约94000的新生蛋白带（F ig 4）. 用薄层扫描仪测得表达量约占菌体总蛋白的34%.融合蛋白为包涵体形式. 经常规变性、复性、亲和色谱纯化，可得到纯化的scFv/hCPA融合蛋白.经流式细胞仪竞争结合抑制实验证 实，该scFv/hCPA融合蛋白具有与人前列腺癌细胞（PC-3和PC-3m）结合的活性.

3讨论

在ADEPT方案中，可以使用基因工程技术产生既有抗原结合活性又有酶活性的融合蛋白，这种融合蛋白与过去化学交联方法的产物相比有更好的均一性. bosslet等^［6］报道了 第1例基 因工程技术得到的抗CEA抗体/β-葡糖苷酶融合蛋白，既保留有抗体的亲和活性，又保留了酶活性. 我们构建的抗PSA scFv和人源性CPA融合基因，为进一步表达较低免疫原性的融合蛋白奠定了基础.

重叠延伸拼接法(SOE)与传统的重组DNA技术相比,它不需要使用限制性内切酶和连接酶，可以避免引入限制性酶切位点的核苷酸序列，可以将两个基因片段精确的连接在一起，是构建融合基因的一种有效手段. 应用SOE方法已构建成功了许多融合基因^［5，7］.我们 通过加端P CR和SOE法构建了序列正确的抗PSA scFv/hCPA融合基因，为前列腺癌的抗体导向酶-前体药物疗法奠定了基础.

图 4GST scFv / hCPA融合蛋白的表达

fig 4Expression of GST scFv/hCPA fusion protein

m: Protein molecular weight standards; 1～4: Induced 1,3,4,5 h respectively; 5: no induced E.coli JM109

基金项目:全军重点实验室基金课题(1997-71-22)

作者简介:武国军(1972-)，男(汉族)，黑龙江省哈尔滨市人.硕士 生(导师张盈华、郝晓柯). 已发表论文8篇.现为西京医院泌尿外科医师，助教. Tel. (029)3375321Email.Guojun wu@163.net武国军（第四军医大学唐都医院中心实验室，陕西西安 710038 ，第四军医大学)

郝晓柯（第四军医大学唐都医院中心实验室，陕西 西安 710038，第四军医大学)

张盈华（第四军医大学唐都医院中心实验室，陕西 西安 710038，第四军医大学)

白玉杰（基础部生物化学教研室)

药立波（基础部生物化学教研室)

季少平（基础部生物化学教研室)