中华医学杂志2000年第80卷第6期

贾兴元刘敬忠向华胡维周艳张鹏

摘要目的构建能表达活性苯丙氨酸脱氨酶(PAL)的重组质粒，使其在乳酸乳球菌(L.L)中表达,将苯丙氨酸(phe)脱氨，从而减少外周血中phe的水平,达到治疗苯丙酮尿症(PKU)或大鼠高苯丙氨酸血症的目的。方法将欧芹PAL cDNA重组到质粒pMG36e中，转化乳酸乳球菌，用聚合酶链反应(PCR)及高效液相色谱法（HPLC）等技术筛选阳性表达株，将工程菌pMG36ePAL/L.L.制成不同剂型，“治疗”高苯丙氨酸血症模型大鼠。结果获得了能表达PAL的乳酸乳球菌基因工程菌株。灌喂pMG36ePAL/L.L.制成的肠溶微囊及抗酸缓冲液体制剂，观察到高苯丙氨酸血症大鼠外周血phe水平明显降低(2组治疗后5 d为1.25 mg%，第12 d为1.75 mg%)，与对照组相比(治疗后5 d为3.75 mg%，第12 d为2.9 mg%)有显著性差异。不同剂型显示出的效果有差别。结论能表达活性PAL的基因工程菌(乳酸乳球菌)的适当口服剂型，能够显著降低高苯丙氨酸血症大鼠外周血phe水平，为基因疗法治疗PKU开辟了一条可能的新途径。

关键词：苯丙氨酸苯丙酮尿症乳酸乳球菌基因疗法

经典型苯丙酮尿症(以下简称PKU)系常染色体隐性遗传病。发病原因是患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因发生突变，造成苯丙氨酸（phe）及其有害代谢产物的大量积累，损伤患儿脑细胞正常发育而导致智力低下、呆傻。现行治疗方法是低苯丙氨酸饮食治疗，不但价格昂贵，要求严格限制天然蛋白的摄取,而且服用时间长(从新生儿一查出至患儿智力发育基本成熟)，患儿难以接受和持久^［1］。国际上PKU专家们建议研究低phe饮食疗法的替代方法^［2］。有用苯丙氨酸脱氨酶(Phenylalanine ammonia lyase, PAL EC4.3.1.5)治疗PKU的尝试^［3］，但均由于酶用量大，成本高,用药途径等原因，尚未见临床试用的报道。用外源性正常人的PAH基因进行的PKU基因治疗研究也尚未见到成功的报道^［4］。

本研究利用基因重组技术，将欧芹PAL cDNA在大肠杆菌中克隆并表达，进而在人类肠道有益菌群乳酸乳球菌中表达，将后者制成适当剂型，口服，使之在小肠之中表达PAL活性，将食物消化液中的phe脱氨，转化成对人体无害的肉桂酸，从而减少进入外周血的phe达到预防及治疗PKU的目的，探索一条PKU基因疗法的新途径。

材料与方法

一、材料

含欧芹(Petroselinum crispum) PAL cDNA的质粒pBS PAL由本研究室构建^［5］。乳酸乳球菌L.L.MG1363由荷兰Groningen大学J.Kok博士惠赠，其内源性质粒已去除，蛋白酶活性被缺失，适合于表达外源性基因产物。表达质粒载体pMG36e由G.Venema教授惠赠。自行设计下列两个引物用于快速鉴定含有PAL cDNA，并且插入方向正确的pMG36ePAL阳性克隆：Pvec.5′TCACAAAATGCTATA-CTAGGTAGG 3′, P_PAL:5′TTAACAGATTGG-AAGAGGAGC 3′。上述引物在中科院微生物所合成。

二、方法

1．组成型表达质粒pMG36ePAL的构建：重组质粒pBSPAL DNA经SnaB Ⅰ和Xba Ⅰ双酶解,纯化出2.2 Kb PAL cDNA片段,pMG36e经EcolCR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶解，目的cDNA片段与载体片段按3∶1混合，常规连接^［6］。

2.电穿孔法转化乳酸乳球菌：感受态L.L.的制备按文献［7］进行。电穿孔用Bio-Rad Gene Pulser进行(2.5 KV/2 mm，25 uF，200 Ω)，恢复培养基用SGM17MC (+phe+Em)，铺平板固体培养基用SGM17+agar(+phe+Em)，30℃厌氧培养2～3 d。

3．乳酸乳球菌工程菌的鉴定及其表达PAL的分析：(1)菌株阳性克隆的筛选用聚合酶链反应(PCR)，按文献［8］进行。

(2)SDS-PAGE法：按常规方法进行^［6］，以含空载体的L.L.为对照。

（3）表达的PAL活性检测：单菌落接种于GM17(+phe+Em)培养基，37℃培养1 d。相同培养基稀释后继续培养，每6h取菌液,进行处理后,HPLC法测phe被PAL脱氨产物肉桂酸的含量，方法详见^［9］。用HPLC法测phe浓度以反映PAL活性。方法详见文献［10］：流速为1 ml/min；检测波长为211 nm。

4．工程菌的冻干及肠溶微囊的制备：离心收集pMG36ePAL/L.L MG1363及pMG36e/L.L MG1363菌泥, 加入冻干保护剂溶液，冷冻干燥至样品含水量少于4%。将冻干菌粉分装后密封，储存在4℃及30℃。在不同时间取样，在GM17(+phe+Em)培养基上划板，30℃厌氧培养72h，检测其活菌数。

采用混合脂包埋法，将pMG36ePAL/L.L MG1363及pMG36e/L.L MG1363冻干菌粉分别制成活菌肠溶微囊，置于人工胃液及人工肠液中不同时间后，于GM17(+phe+Em)培养基上划板。30℃厌氧培养72 h，对菌落进行计数，并计算保护效果。

5.工程菌活菌灌胃液体剂型的制备：(1)抗酸缓冲型：pMG36ePAL/L.L.工程菌在MRS培养基(加有PBS缓冲剂：pH 8.0, 0.1mol/L)中厌氧培养至10⁹/ml。(2)含NaHCO₃型：将工程菌菌泥用含phe 25 mg/ml的NaHCO₃等渗水溶液(pH 8.0)悬浮，该制剂含活菌10¹⁰ CFU/ml。

6.高苯丙氨酸血症大鼠模型的基因疗法实验：第一批动物实验选健康雄性大鼠，体重100～120 g。从第1～3 d连续3d，每天一次腹腔注射p-CP 300 mg/kg体重，及100 mg phe/kg^［11］。第4～12 d，每天灌喂一次50 mg/2 ml的phe溶液。从第1 d到第12 d，治疗Ⅰ组(11只)，每天喂含活菌数达10⁹的PAL L.L.工程菌肠溶微囊；治疗Ⅱ组(10只)，每天一次灌喂抗酸缓冲型基因工程菌液2 ml；对照组(10只)，每天一次灌喂含活空载体菌约10⁹的肠溶微囊。

第二批动物实验中，除治疗组(15只)灌喂的基因工程菌剂型由抗酸缓冲型改为含NaHCO₃型，对照Ⅰ组(15只)由空载体菌肠溶微囊型，改为空载体菌含NaHCO₃液体型，对照Ⅱ组(11只)则灌喂不含任何菌的含NaHCO₃等渗溶液，其它条件与第一批动物实验相同。于治疗试验第1、5、12 d，取大鼠尾尖血，HPLC法测定phe含量。于第1、10 d，取大鼠粪便，测定细菌总数、乳酸乳球菌数及其百分含量(见方法7)。

7.实验大鼠粪便中细菌总数/乳酸乳球菌含量的测定：取1 g粪便，悬浮在9 ml生理盐水中，进行进一步稀释，分别在BL、EG、TS和GM17(+phe+Em)培养基上划板。TS培养基在37℃有氧培养24 h，其余三种37℃厌氧培养72 h。进行革兰氏染色分析，统计各皿细菌总数和乳酸乳球菌(GM17皿)数及其在总细菌数中所占百分比。

8.统计学处理方法，采用t检验，在SPSS软件上进行。

结果

1.组成型表达重组质粒pMG36ePAL的亚克隆构建及电穿孔法转化乳酸乳球菌。pMG36ePAL的构建按图1流程进行。连接产物电穿孔法转化感受态L.L.的转化效率约1.0～1.3×10³转化子/μg质粒DNA。

2.能表达活性PAL的乳酸乳球菌工程菌的筛选与鉴定：PCR技术快速筛选阳性克隆的电泳结果见图2。有2.2 Kb扩增带的即为有PAL cDNA插入且方向正确的克隆。

随培养时间的延长，阳性克隆工程菌培养基中肉桂酸浓度逐渐增加(图3)，24 h已达1.778 mg/ml。说明工程菌所表达的PAL具有较好的使phe脱氨生成肉桂酸的活性和特异性。同时测定了phe量的变化，结果显示随培养时间的延长，phe含量逐渐降低。

图1pMG36ePAL构建流程图

M：λDNA/Hind Ⅲ酶解物，1～5为不同菌株，特异扩增带为2.2 kb图2PCR技术快速筛选有PALcDNA正确插入的阳性克隆

图3用HPLC测定pMG36ePAL/L.L.工程菌培养液中肉桂酸生成量动态图

3.工程菌冻干保护剂的选择及肠溶微囊的制备：在所试用的5种冻干保护剂中，以脱脂牛奶+10%蔗糖为最佳，3个月时冻干活菌指数为10.45，存活89.2%；其次为脱脂牛奶+10%乳糖。

利用这种冻干保护剂制得冻干菌粉，进而制成肠溶微囊，在体外人工胃液、人工肠液试验表明，其对活菌的保护率达70%。

4．能表达活性PAL的乳酸乳球菌工程菌口服制剂，治疗高苯丙氨酸血症大鼠的疗效观察：第一批动物实验结果见图4。治疗Ⅰ组、Ⅱ组、对照组分别灌喂肠溶微囊、缓冲型液体剂型及空载体菌。可见治疗Ⅰ组和Ⅱ组均显示出明显的降低高苯丙氨酸血症大鼠外周血中phe水平的作用，差异有显著意义；并且缓冲型液体剂型比肠溶微囊效果要好。

^*与对照组比较差异有显著意义<