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摘要： 目的观察外源性人表皮细胞生长因子（hEGF）基因导入正常角朊细胞后，能否表达及分泌hEGF；为深入探讨hEGF的作用机制及临床应用奠定物质基础.方法脂质体包埋hEGF cDNA的真核表达质粒pcDNA3-hEGF转染人角朊细胞，经G418筛选、克隆、扩大及传代培养转基因的角朊细胞.特异性neo探针原位杂交显示转基因细胞内的质粒载体；hEGF抗体免疫细胞化学法观察转基因细胞内hEGF的表达；采用放射免疫分析测定细胞向胞外分泌hEGF的情况.结果pcDNA3-hEGF可经脂质体介导有效地转染角朊细胞；G418筛选纯化转基因后的角朊细胞内含转入的真核表达质粒，胞质内有阳性hEGF表达；并向胞外分泌hEGF.结论由真核表达质粒pcDNA3-hEGF转染人角朊细胞获得的含外源性hEGF基因的角朊细胞具有表达分泌 hEGF的功能.
关键词:基因转染；人表皮细胞生长因子；角朊细胞
0引言
生长因子EGF，bFGF，TGF，PDGF等参与损伤后组织细胞的增殖、分化、以及基质形成等再生过程；因此，成为组织修复领域的研究热点之一［1］.临床实验发现，生长因子促进创面愈合的效果与能否达到有效的用药浓度及维持药物作用时间具有直接关系；迄今为止，人们尚不能找出理想的办法来解决这些问题，因而阻碍了其应用［2］.我们拟在应用已构建的真核细胞表达质粒pcDNA3-hEGF，转染体外培养的人角朊细胞，然后对其进行纯化及扩大培养，希望获取具有持续分泌hEGF功能的人角朊细胞；为临床探索开展hEGF结合角朊细胞移植修复皮肤创面的新途径提供实验依据.
1材料和方法
1．1材料培养基：DMEM，K-SFM（Gibco）；蛋白酶：胰蛋白酶（Difco）、dispase酶（日本和光纯药株式社）、蛋白酶K（Sigma）；限制性核酸内切酶：HindⅢ，SalI（Promega）；脂质体(Sigma)，2 g·L-1， G418（Gibco）；DIG-DNA标记kit（Boehringer manheim）； WizardTM Plus Milipres DNA纯化kit（Promega）；BCIP/NBT显色kit（Boster）；兔抗hEGF（Santa cruz Biotechnology）；hEGF放射免疫分析测定Kit（北方生物技术研究所）.质粒：①pcDNA3-neo，真核表达质粒，本校生物化学教研室惠宏襄副教授惠赠；②pcDNA3-hEGF，含编码hEGF的cDNA，本科实验室构建［3］；③pBMG-neo：含位于酶切位点为SalI与HindⅢ间的片段大小2.6 kb的neo基因（来源同①）.
组织标本来源：健康手术切除的包皮.
1.2方法按Rheinwald 等［4］的方法改进，分离及培养人角朊细胞(human keratinocyte，HK). 采用Dispase酶(1.25 g·L-1)冷消化，分离表皮；胰酶(2.5 g·L-1)热消化,制备细胞悬液；适当密度接种细胞，无血清HK完全培养基K-SFM培养，隔日换液.培养达80%融合的HK分组：采用脂质体lipofectamine将pcDNA3-neo，pcDNA3-hEGF分别转染细胞.转染72 h后，加入含G418的培养基，G418最高浓度为300 mg·L-1；2 wk后，出现小克隆，待克隆细胞生长至近融合时，传代扩大培养用于实验.
细胞爬片用纯丙酮固定，行特异探针(neo基因片段)原位杂交分析.①neo探针的制备： pBMG-neo质粒转化宿主菌JM109，WizardTM plus Milipres DNA纯化Kit提取并纯化质粒；采用SalI/HindⅢ双切纯化的pBMG-neo质粒，切下2.6 kb的片段即为neo基因片段，回收片段，紫外定量；②探针标记：按Dig-DNA标记Kit说明进行；③杂交主要过程：在细胞爬片上加1 mg·L-1的蛋白酶K，37℃消化30 min后，三乙醇胺、乙酸酐、乙醇处理，空气干燥.每张细胞爬片加杂交液100 μL，加硅化盖玻片，石蜡封闭，于密闭湿盒中50℃反应14 h. 滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体复合物，37℃孵育2 h. 按BCIP/NBT显色kit说明显色.常规乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片，镜下观察.
细胞爬片经10 mL·L-1 H2O2处理后加正常山羊血清37℃温育20 min，甩去多余液体；加1∶50稀释的兔抗hEGF抗体（阴性对照组加不含抗体的PBS)，4℃反应12 h；1∶100稀释的生物素化山羊抗兔IgG，37℃温育20 min；1∶1000稀释的Texas red标记的亲合素，室温反应12 h， 500 mL·L-1甘油(含25 g·L-1 Gibco)封片，选择激发光580 nm波长，荧光显微镜下观察细胞内hEGF的表达.
将正常培养的及经G418筛选的转基因HK，均以2×105 cells·L-1，1 mL·孔-1接种24孔板，每种HK重复8孔，培养12 h后用不含添加剂的K-SFM换液, 继续培养；并于培养后1～7 d的相应观察时间点收集培养上清，-20℃保存待测.按hEGF放射免疫分析测定Kit的操作说明，对收集的HK培养上清内hEGF含量进行测定.
2结果
2.1培养的正常HK及转染后生长情况体外培养的正常原代及传代HK，其生长状况均良好，以3×105 cells/瓶接种于3.5 cm×6.5 cm大小的培养瓶，K-SFM培养基培养1 wk即可达80%融合，满足转染需求(Fig1). 转染后72 h细胞生长达100%融合，形态况均良好（Fig 2）.
2.2应用neo探针细胞原位杂交结果结果显示转染pcDNA3-neo空载体、pcDNA3-hEGF并经G418筛选后的HK细胞内均有载体质粒存在，对照组未转染的HK细胞则呈阴性；载体所处位置在胞质近核膜周围（Fig3,4）.
2.3转基因HK胞内目的基因表达阴性对照、正常及转染空载体的HK，在波长为580 nm激发光下，可见极弱的荧光（Fig 5）.转染含目的基因的质粒pcDNA3-hEGF的HK，于胞质内可见表达相应的产物hEGF，其分布以近核膜附近较强(Fig6).
2.4转基因HK培养上清hEGF含量转基因HK培养上清组，可检测到hEGF；培养1 d为(22±6) μg·L-1，3 d时达(37±17) μg·L-1，7 d时仍维持在较高的水平(35±14) μg·L-1；正常HK细胞培养上清组及转空载体HK培养上清组均检测不到hEGF.
3讨论
现代医学的进步使复苏技术及其他全身支持治疗达到了相当高的水平；因此，在病程的早期挽救了很多大面积严重烧伤患者的生命，同时使烧伤临床治疗的进一步提高面临着新的疑难问题有待解决；其中最重要的问题之一是如何尽快有效地覆盖修复皮肤广泛缺损的创面，这对保证早期全身生命支持治疗的巩固及提高烧伤患者创面愈合后功能和外形的恢复起决定性作用［5］.
探索角朊细胞基因转染用于创面治疗的研究已有一些报道.1994年，Vogt等［6］用逆转录病毒载体α-SGC-hGH(含人生长激素基因序列)改造猪角朊细胞成功地表达了hGH，并移植猪创面上，可加速创面上皮化.1997年，Sun等［7］将aFGF的cDNA克隆入表达质粒PMEXneo-SP-aFGF，直接传染患糖尿病的小鼠创面，可显著促进创面愈合.1998年，Eming等［8］将经逆转录病毒载体MFG-PDGF-A(含人血小板源性生长因子-A基因序列)改造的人角朊细胞用于皮肤组织工程研究；其方法为把改造的角朊细胞种植于去细胞的真皮表面制成复合皮，然后移植于动物全层皮肤缺损创面，发现这种复合皮在移植后早期的关键几天内迅速出现血管再生细胞并伴随有新生基质形成，其覆盖的皮肤创面修复质量较对照组明显提高；放射免疫测定显示复合皮内含有高水平的PDGF-AA.1999年，我们首先报道了pcDNA3-hbFGF(含人碱性成纤维细胞生长因子基因序列)转染的人角朊细胞培养上清液可显著促进人真皮成纤维细胞生长增殖［9］.
图1正常人角朊细胞培养后7 d，达80%融合，可用于转染
fig 1In 7 d culture, the normal human keratinocytes grew about 80% confluence, ready for gene transfection×100
图2转染HK细胞培养72 h外观
fig 272 h after tansfected with pcDNA3-hEGF, keratinocytes grew about 100% confluence×100
图3应用neo探针原位杂交示正常培养的HK细胞内无质粒载体，结果阴性
fig 3Negative result of normal human keratinocytes in situ hybridized with probe neo BCIP/NBT staining×100
