第四军医大学学报2000年第21卷第5期

李刚刘维永晏培松郝树藩

摘要： 目的探讨风湿性心脏病心肌组织Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA的表达和定位，以及胶原改 建对心功能的影响.方法用人Ⅰ，Ⅲ型前胶原cDNA探针，对32例风湿性二尖瓣乳头肌进行 分子原位杂交并进行图像分析.结果病变心肌间质中Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRN a阳性表达明显增 多，Ⅰ型较正常成年心肌中增高1.67倍，Ⅲ型增高4.36倍；病变心肌细胞核内出现Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达，胎儿心肌亦有类似表达；Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达量与左室射血分数(EF)，左室周径向心缩短率(mVcf)呈负相关.结论风心病心肌细胞参与了胶原的合成和分泌，并对心脏功能有严重影响；风心病心肌胶原增生重现了胎儿期合成胶原的表型.提示调控和逆转心肌胶原增生对慢性风心病的防治展示了一条新的途径.

关键词：风湿性心脏病；心肌；胶原；心肌细胞；间质

0引言

我科应用原位杂交结合显微图像分析对Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA在风湿性二尖瓣乳头肌中的表达进行检测，探讨其与病变心肌间质增生的关系和对心功能的影响.

1材料和方法

1.1材料实验组心肌标本32例，取自风心病二尖瓣替换术中.对照组：均 为非心脏疾病死亡尸检标本，其中成年正常心肌标本17例，胎儿心肌标本2例.取下的新鲜标本立即放入Bo uins液中固定，而后脱水包埋，制成蜡块，切片待检.

1.2方法

1.2.1原位分子杂交胶原基因重组质粒JM1b， S₄₁₃分别含人Procolα1(Ⅰ)型和Procolα1 (Ⅲ)型胶原的cDNA片段，系德国Prockop实验室构建，经内切酶EcoRⅠ进行酶切，低溶点琼 脂糖回收酶切后cDNA片段，变性后用异羟基洋地黄毒苷配基-11-dUTP随机引物延伸法标记做 为探针. 组织预处理及杂交过程分别按文献［1］及试剂盒操作指南进行；杂交后用碱性磷 酸酶标记的抗Dig抗体检测，NBT／BCIP显色、脱水、透明、封片.杂交中设立阳性对照；Di g标记的HPV₁₁ DNA杂交替代对照；RNase消化组织对照.

1.2.2免疫组化染色用兔抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体和鼠抗人Ⅲ型胶原mAb作为Ⅰ抗，然后按文献［2］方法进行染色.设正常心肌标本对照、空白对照及替代 对照.

图像分析和统计学处理： 采用Mias-300图像分析系统对分子杂交阳性信号进行检测，并将图像分析定量结果与心功能指标、血管活性药用量等进行对比研究，统计学处理和相关回归分析.

2结果

2.1前胶原mRNA在正常成年心肌标本中心肌间质成纤维细胞和血管内皮细胞核内可见Ⅰ型前 胶原mRNA的阳性表达，呈深蓝色，均位于细胞核内.Ⅰ型前胶原mRNA的阳性表达，明显多于 Ⅲ型，心肌细胞内均未见有Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达（Fig1A, 2A）. 在胎儿心肌细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞内均可见Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA呈阳性表达（Fig1B, 2B）. 利用图像分析仪对正常成年对照组前胶原mRNA的分布情况进行分析发现Ⅰ型前胶原mRNA的阳性表达细胞均数为185±63, Ⅲ型为44±38. 实验组心肌间质中Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA阳性呈散在分布，血管周围分布明显增多，间质中Ⅰ型阳性表达量多于Ⅲ型.值得注意的是在风 湿性心脏病的肥大心肌细胞内亦出现Ⅰ,Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达.均位于细胞核内（Fig 1C, 2C）.

图像分析： 病变心肌间质中Ⅰ型前胶原mRNA阳性表达细胞均数为310±125,Ⅲ型前胶原mRN A阳性表达细胞数为192±68. 与对照组相比，Ⅰ型前胶原mRNA阳性表达细胞数上升了1.67倍， P＜0.01； Ⅲ型阳性表达细胞数上升了4.36倍， P＜0.01 (Fig3).[ FL)〗

图1原位分子杂交I型前胶原mRNA在成年正常心肌(A)、胎儿心肌(B)和风心病心肌(C)中表 达

fig 1Expression of type I precollagen mRNA (in situ hybridization)×400

positive expression in the nucleus of fibroblasts and endothelial cells, but negative expression in cardio myocyte in normal adult myocardium (A). In addition to fibroblast and endothelial cells, th ere was a positive expression in the nucleus of hypertrophic myocardiocytes in fetal (B) a nd rheumatic (C) cardiomyocytes.

图2原位分子杂交Ⅲ型前胶原mRNA在成年正常心肌(A)、胎儿心肌(B)和风心病心肌(C)中 表达

fig 2Expression of type Ⅲ precollagen mRNA (in situ hybridization)×40 0

positive expression in the neucleus of fibroblasts and endothelial cells, but negative expression in ca rdiomyocyte in normal adult myocardium (A); In addition to fibroblast and endothelial cells, there was a positive expression in the nucleus of hypertrophic myocardiocytes, in fetal (B ) and rheumatic (C) cardiomyocytes.

图3免疫组化检查Ⅰ型(A)和Ⅲ型(B)胶原在风心病心肌细胞内呈阳性表达，心肌间质和增厚小血管壁中亦有阳性表达（苏木素衬染核）

fig 3Positive expression of collagen type Ⅰ(A), Ⅲ(B) in rheumatic cardiomyocytes, also in the interstitium and arteriolar wall in myocardium. immunohistochemistry me thod×200

2.2胶原蛋白免疫组化检测阳性表达信号为棕黄色.在病变心肌间质中 呈阳性表达的纤维呈束状或片状分布，特别是增厚的心肌间质血管壁最为明显.心肌细胞中阳性表达信号 亦非常明显. 均在细胞内（Fig 4）.

图4对照组与病变组Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达细胞数比较

fig 4Comparison between control group and rheumatic group in cell num ber of the positive expression of type Ⅰ, Ⅲ precollagen mRNA

2.3心功能检测与实验组比较发现，Ⅰ型前胶原mRNA阳性表达细胞数与左室射血分数(EF) 及左室周径向心缩短率(mVcf)均呈负相关，即随前胶原mRNA表达量的增加，EF值和mVcf均呈下降趋势（Fig 5, 6）. 手术后血管活性药物用量则随前胶原mRNA阳性表达量的增加呈相应增加趋势. 其中以多巴胺的用量与Ⅰ，Ⅲ型mRNA阳性表达的量效关系比较密切（Fig7）； 与硝普钠用量间无明显关系.

图5病变心肌Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达细胞数与EF值相关关系

fig 5Relationship between EF and cell number of positive expression of typeⅠ, Ⅲ precollagen mRNA in rheumatic myocardium

3讨论

一般认为Ⅰ，Ⅲ型胶原由心脏间质成纤维细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞合成或分泌，心肌细胞无合成Ⅰ，Ⅲ型胶原的功能^［3］. 1996年樊宏等^［4］用免疫组化方法检测到风湿性 瓣膜病心肌细胞质内有Ⅰ，Ⅲ型胶原表达.我们经原位杂交，进一步证实风湿性心肌细胞 核 内有Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA的阳性表达.提示：风湿病心肌细胞参与Ⅰ，Ⅲ胶原的增生，且可能发生在细胞核转录过程中，首先从mRNA译得前胶原α肽链，后者并与内质网膜形成核膜蛋白结合体，由内质网分泌到细胞外.

图6病变心肌Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达细胞数与左室周径向心缩短率(mVcf)相关关系

fig 6Relationship between mVcf and cell number of positive expression of typeⅠ, Ⅲ precollagen mRNA in rheumatic myocardium

图7病变心肌Ⅰ，Ⅲ型前胶原mRNA阳性表达量与术后多巴胺用药量的相关关系

fig 7Relationship between dopamine dosage used in postoperation and cell number of positive expression of type Ⅰ, Ⅲ precollagen mRNA in rheumatic myocardium