中国药理学通报2000年第16卷第1期

郭庆民刘景生

摘要基因治疗包括功能基因转移至宿主细胞，用于校正特定基因的功能缺陷或减轻疾病的症状。对于心血管疾病的基因转移，腺病毒载体最有效。该文从方法学上回顾了血管NOS基因转移领域的最新进展以及NOS基因转移对重要心血管疾病的潜在应用。NOS基因转移方法在动物模型中具有可行性，但是，当前可用的载体还有许多技术和安全限制。在用于人类心血管疾病NOS基因治疗前必须给予克服。

关键词：一氧化氮合酶基因转移心血管疾病

现已证明内皮源性舒张因子（EDRF）就是NO。乙酰胆碱等许多物质的舒血管作用，系首先作用于血管内皮使之释放NO，随之产生效应。NO扩血管功能障碍参与许多疾病的病理发生，如动脉粥样硬化、血栓形成、高血压、糖尿病和血管痉挛。NO的生物学功能包括舒张血管，抑制平滑肌增生、白细胞粘附、血小板聚集和粘附。对于预防和治疗心血管疾病具有有益的作用。然而，NO的生物半衰期很短，NO供体易耐受和产生其他副作用，使NO的应用受到限制。最近^［1］通过NOS基因转移的方式来恢复 nO 的生成，在体内和体外重组NOS基因异构体的表达可以改变各种血管床的功能，这可能在将来的心血管疾病NOS基因治疗中具有重要作用。

1选择NOS基因的异构体:合成型(eNOS, nNOS)或诱导型(iNOS)

合成型和诱导型NOS的一个重要区别在于它们的活性对Ca²⁺的依赖性和它们产生的NO的数量不同。eNOS和nNOS的活性被细胞内Ca²⁺水平所严格调控,可以在纳摩尔水平上，刺激NO的快速生成；相反, iNOS的活性通常以Ca²⁺非依赖的方式被诱导，在毫摩尔水平上产生NO。因此,选择哪种NOS形式进行基因转染，依靠其对一个特定血管疾病的血管床的类型和它所需的NO数量。然而要选择正确的酶是非常复杂的，因为每一个NOS蛋白都具有不同的细胞定位和组织特异性调节，它们的复合物都需要辅助因子。

NOS蛋白的组织特异性调节以不同血管细胞(如内皮细胞和心肌细胞)、不同的caveolin异构体与eNOS相联系作为例证^［2］。位于内皮细胞和心肌细胞的caveolae中的eNOS通过caveolae整体-膜结构蛋白分别与caveolin-1 ,-3相联系^［3］。近来发现caveolin对eNOS活性的直接作用是抑制,这种抑制作用可以被Ca²⁺-钙调蛋白所完全逆转。因此，通过Ca²⁺-钙调蛋白与caveolin之间的相互作用对eNOS的活性进行调节^［2］。细胞内Ca²⁺升高,促进钙调蛋白和eNOS结合, caveolin 与eNOS分离,激活的eNOS-钙调蛋白复合物合成NO，直到细胞内Ca²⁺下降,引起eNOS-caveolin复合物重新形成。另外, eNOS在caveolae中的定位可以通过一个caveolar复合物的形成促进NO的形成^［2］。其中eNOS和精氨酸传递蛋白的共位使细胞外精氨酸到膜结合的eNOS的直接传递变得容易。近来^［4］，两个G蛋白偶联受体毒蕈碱M₂和缓激肽β₂受体分别在心肌细胞和平滑肌细胞的caveolae中由激动剂结合后促进eNOS的分离，从而导致功能性的eNOS从caveolae到细胞液的释放和转位。

nNOS 和eNOS相比，结构和激活时对Ca²⁺的需求和同caveolin相互作用方面相似,这可能是Ca²⁺依赖的NOS的一个普遍特性^［2］。而iNOS可能不需要caveolin与Ca²⁺-钙调蛋白的相互作用调节。这样，caveolin和eNOS(而不是iNOS)的相互作用,在调节NOS功能方面起重要作用，在进行基因转移选择NOS异构体时应考虑这个复合物。

2选择靶细胞-内皮细胞,平滑肌细胞或外膜成纤维细胞

典型的血管壁由血管内壁（内皮细胞，EC）、中层（平滑肌细胞，SMC）和外膜层（成纤维细胞，外周血管神经），这三层都可表达重组NOS蛋白。然而，把血管壁的一个特定的层或一个层中特定的细胞作为靶，可以对不同的疾病产生不同的治疗效果，问题在于能否在体内不同的血管层中得到位置特异的NOS基因表达。

以前的研究证明：在体内，内皮细胞转基因表达可以以细胞介导^［5］，通过导管或直接的途径进行。另外载体注入到外周动脉鞘或者通过脑脊液注入脑动脉已在体内的外膜转基因表达取得成功^［6］，这些研究证明基因在内皮和外膜上的转移具有可行性。相反，尽管重组eNOS已经证明可以在培养的平滑肌细胞上表达，要想获得体内SMC特异的NOS表达，因为没有特异的启动子（比如CMV、RSV）用于载体结构，可能比较困难。为了得到可控制的SMC的转基因表达，需特定类型细胞启动基因启动NOS基因的表达。最近，SMC一种SM22α启动基因转录控制下的腺病毒载体已成功地用于体内SMC特定基因表达。

3选择合适的载体进行NOS基因转移

血管的基因转移指的是将基因导入相关的血管壁细胞中，病毒和非病毒载体都可以用于NOS基因转移。NOS基因的表达可以被CMV和RSV即刻早期基因促进。用于基因转染研究的病毒载体包括腺病毒(Adenovirus),逆转录病毒(Retrovirus)和在DNA-核蛋白-病毒-脂质体复合物中的HVJ(Sendai virus,仙台病毒)。

3.1腺病毒

3.1.1腺病毒载体在100多种腺病毒血清型中，人血清型2和5^［1，7］作为基因转移载体最常应用。在异种的CMV和RSV作用下，外来基因可嵌入腺病毒表达盒子。对于病毒载体，重组腺病毒载体成为血管基因转移的最佳选择。腺病毒载体的优点^［7］包括①具有包括转导非分化血管细胞的各种类型细胞的能力。②在体内和体外都具有较高的转移效率。③产生高浓度载体储备至10¹² nfu·L^-1 (指暴露组织中的实际浓度)的能力。④病毒不整合到宿主细胞的基因组，与人类的任何恶性肿瘤的发生无关。但是，第一代和第二代载体存在一些问题。有一些病毒蛋白仍可以在转导的宿主细胞上表达^［8］，可引发细胞的（CD⁺₄，CD+₈，T细胞）和体液的（B细胞产生的中和抗体）免疫反应。宿主的免疫性不仅影响着转基因表达的持久性，而且阻止病毒的再次注射。成人对于腺病毒血清型2和5在无腺病毒先前暴露史时产生一高效价的预先存在的免疫反应。近来，从腺病毒设计的角度，在阻断免疫原病毒蛋白的表达或宿主免疫反应方面进行了有益的尝试^［1］。去除所有病毒DNA的第三代腺病毒载体已经合成。用这些“挖空的”腺病毒载体可产生持久的基因表达，和很少的免疫反应。最近报道，另一种构建Adv表达载体的新方法，建立表达基因的E-Adv^［9］。

3.1.2腺病毒受体最近，由分子克隆的方法鉴定coxackie B病毒和腺病毒血清型2和5具有共同的受体，命名为CAR^［1］。这个受体是一相对分子量为46 ku的跨膜糖蛋白，由365个氨基酸组成，序列分析提示它属于免疫球蛋白基因超家族。腺病毒受体的位置分布于染色体21上。CAR-cDNA转染至无天然C aR的细胞系，结果导致有功能的CAR的表达。

在将靶基因转移至特异的组织方面，CAR作为腺病毒有功能的受体和它的组织分布具有重要意义。Northern印迹分析证明在人体一些组织（比如：心、脑、胰）中CAR mRNA有很强的表达，而在其他组织表达很弱（如：肝、肺）或没有（如：肾、胎盘、骨骼、脾）。这些结果表明，由腺病毒介导的转基因表达的效率和在不同的组织和细胞中CAR表达的程度有关。由于受体缺失，具有纤毛的气道上皮细胞对于腺病毒感染有抗性。对于重组eNOS表达来说，存在于脑血管和外周血管的异源性可反映CAR表达在这些血管上的不同。

3.2逆转录病毒（retrovirus）载体^［7，10］逆转录病毒载体首先在心血管系统的应用是在体血管内皮细胞的基因转染。逆转录病毒载体可以稳定高效的将所携带的目的基因整合入靶细胞的染色体并随宿主细胞基因的表达而表达，可用于心血管系统基因转染的体外研究。逆转录病毒有以下缺点：①只感染可分裂增殖的细胞，而对非分裂细胞无作用。其转染靶细胞的作用依赖于细胞的有丝分裂而非DNA的合成。②插入性基因突变。逆转录病毒载体携带的基因片段随机插入宿主染色体易引起基因突变。③转录效率低，稳定性差。

3.3仙台病毒（sendai-virus），又名（hemagglutinating virus of Japan，HVJ）对于仙台病毒的研究有待进一步深入^［11］。该病毒特有的细胞膜融合能力可使这种载体以较高的速率介导基因转移。这种融合特性可使DNA直接进入细胞质易化，避免溶酶体降解。在病毒被膜上有两个独特的糖蛋白（hemagglutinating neuroaminidase和fusion protein），前者可以将病毒颗粒结合到细胞膜受体上而催化去除糖，后者和细胞膜脂质双层相互作用，促进细胞融合（尽管脂质体自身没有病毒受体，融合蛋白的F1多肽与脂质直接相互作用可能在HVJ和脂质体融合方面起重要作用）。已有报道用UV灭活的HVJ和脂质体融合形成包含DNA的融合病毒脂质体^［11］。其优点是：①可以和质膜在37℃，10～30 min完成融合。这样短的孵育时间，尤其适合体内的基因转移。②其转移使分子直接进入细胞质，可避免溶酶体降解。③能够在同一颗粒中介导DNA和核蛋白进入提高转基因表达。④转染效率高，可包含长至100 kb的DNA。⑤转染后宿主没有出现明显的毒性，抗原性小。⑥它对现在常用的载体是一种提高。融合的病毒脂质体可