中国医科大学学报2000年第29卷第2期

张艳红金镇曲陆荣陈桂兰姜卫国高红

摘要目的：探讨细胞凋亡在妊娠维持中的作用。方法：采用凝胶电泳技术及S-P免疫组化技术，对20例早期妊娠避孕失败者(A组)及10例自然流产者(B组)的绒毛及蜕膜组织，进行DNA片段分析、p53基因产物(Tp53)、Fas-配体(Fas-L)蛋白基因产物表达检测。结果：A组20例有80％蜕膜组织出现DNA梯形条带，而绒毛组织则无；B组全部绒毛及蜕膜均出现DNA梯形条带；Tp53在A组绒毛及蜕膜组织中均未见表达；在B组中表达阳性率为80％，二组比较有明显差异；Fas-L在A组绒毛及蜕膜组织中的表达阳性率分别为40％、50％；在B组绒毛及蜕膜组织中均为100％，两组绒毛间、蜕膜间比较均有明显差异；Fas-L在绒毛中阳性表达的细胞为滋养细胞，在蜕膜中阳性表达的细胞为蜕膜细胞及腺管皮细胞。结论：早期妊娠中，蜕膜细胞以凋亡形式死亡，在胚泡植入及胎盘形成过程中发挥重要作用；在自然流产中，绒毛及蜕膜细胞的凋亡受p53基因及Fas-L的共同调控，凋亡过度可能是其发病的分子机制。

关键词：绒毛蜕膜细胞凋亡p53基因产物Fas-配体

正常妊娠过程中，与胚泡植入的同时，子宫内膜间质细胞增殖、分化成蜕膜细胞；随着胚泡的生长，周围蜕膜发生广泛的退化与重建。由于蜕膜细胞在胚泡植入及滋养细胞侵蚀母体血管，保证胎盘血液供应时，形成一个潜在的屏障，所以蜕膜细胞死亡在胚泡植入及胎盘形成过程中发挥重要作用^［1］。文献报道，蜕膜细胞通过凋亡死亡^［2］。细胞凋亡是一种主动自我破坏过程，需特定基因表达及酶的参与，亦可通过细胞因子及受体调控^［3］；核的改变发生较早，DNA断裂形成的200 bp片段的梯形条谱，为细胞凋亡的特征性变化。Fas是死亡因子Fas-配体(Fas-L)的受体，可以介导细胞凋亡^［4］；抑癌基因p53与细胞凋亡密切相关。本实验通过对人蜕膜及绒毛组织DNA片段的分析及TP53、Fas-L的组织学检测，旨在探讨人类妊娠期是否发生蜕膜及绒毛细胞凋亡；蜕膜及绒毛细胞的凋亡是否伴有TP53及Fas-L的表达；蜕膜细胞凋亡异常与自然流产的关系。

1材料与方法

1.1标本来源

1996年5月～1997年5月在我院妇产科门诊就诊者。A组为妊娠6～8周避孕失败者，20例，尿HCG阳性，B超检查有胎心胎芽反射；B组为妊娠6～8周自然流产者，10例，尿HCG阳性，B超检查无胎心胎芽反射，或因阴道流血24 h内行清宫术者。两组患者术前3个月内均未服用激素类药物或患感染性疾病。

1.2实验方法

1.2.1取样：将吸取的蜕膜、绒毛组织分装，配对，部分置－70℃保存，部分置于10％福尔马林中固定，备检测。

1.2.2蜕膜及绒毛组织DNA片段分析：

1.2.2.1药品及仪器：药品均购自华美生物工程公司。使用英国产 hERMLE2383K低温高速离心机，BIO-RAD垂直板电泳槽，日本产SHIMADZU uV-1201紫外分光光度仪，北京产WFH-202型紫外透射仪。

1.2.2.2主要步骤：(1)将组织匀浆后置于细胞裂解液中，37℃摇晃过夜；(2)经典法酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇抽提DNA；(3)检测各DNA溶液260 nm及280 nm下的光密度值，以OD₂₆₀、OD₂₆₀与OD₂₈₀之比,计算DNA溶液浓度,检测DNA纯度；(4)将等量DNA(10μg)样品置3.0％聚丙烯酰胺凝胶孔中电泳，60 V，4 h；(5)将凝胶置0.5μg/ml溴乙啶中染色30 min；(6)紫外透射仪观察DNA条带、拍照。

1.2.3蜕膜及绒毛组织TP53及Fas-L免疫组化分析：

1.2.3.1药品：鼠抗人p53-IgG、兔抗人Fas-L-IgG均购自美国DAKO公司。SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1.2.3.2方法：采用S-P法，鼠抗人p53-IgG、兔抗人Fas-L-IgG工作浓度均为1∶100。

1.2.3.3免疫组化对照：阴性对照用PBS代替p53、(Fas-L)-IgG单克隆抗体。

1.2.3.4结果判定标准：TP53强阳性(++)：5个高倍镜视野内2/3以上细胞核着色；弱阳性(+)：5个高倍镜视野内2/3以下细胞核着色；阴性(-)：全部细胞未着色或与背景一致。Fas-L强阳性(++)：5个高倍镜视野内2/3以上细胞见粗大棕红色颗粒；弱阳性(+)：5个高倍镜视野内2/3以上细胞见淡红色颗粒，或2/3以下见粗大红色颗粒；阴性(-)：全部细胞未着色或与背景一致；

1.2.4统计学处理：

本实验样本数n＜40，理论值T＜5，需用四格表确切概率法，直接计算概率做判断，概率＜或=0.025为差别有统计学意义，概率＜或=0.005为差别有高度意义。

2结果

2.1DNA片段电泳分析

标本聚丙烯凝胶电泳结果，A组20例，绒毛均未见 DNA断裂的梯形条带，而相应的蜕膜组织，有18例呈现凋亡的典型特征,即DNA梯形条带，凋亡阳性率为90％。B组10例，绒毛及蜕膜组织均呈现200 bp左右阶梯，且从断裂条带数量上看，蜕膜DNA碎片多于A组蜕膜。

2.2TP53在绒毛及蜕膜组织中表达的免疫组化分析

A组20例，绒毛及蜕膜组织细胞核均未着色，即无TP53表达。B组10例中，绒毛与蜕膜各有8例细胞核着色呈阳性表达，阳性率均为80％；绒毛中阳性细胞为滋养细胞；蜕膜中阳性细胞为蜕膜细胞及腺管上皮细胞。表达强度均为＋。

2.3Fas-L在绒毛、蜕膜组织中的组化分析

A组20例绒毛组织中有8例呈阳性表达，阳性率40％，20例蜕膜中有10例呈阳性表达，阳性率为50％；B组10例绒毛及蜕膜组织均呈阳性表达，阳性率为100％。两组绒毛间、蜕膜间阳性率比较，差异有显著意义(P=0.0015＜0.005,P=0.006＜0.025)。

呈阳性表达的细胞均为胞浆着色。绒毛中出现阳性表达的细胞为滋养细胞，蜕膜中出现阳性表达的细胞为蜕膜细胞及腺管上皮细胞。在B组10例绒毛中，还出现不同程度水肿，且间质细胞呈阳性表达。

3讨论

关于生殖领域细胞凋亡的研究，迄今仅限于动物实验，尤其是关于蜕膜细胞凋亡的研究，多数是通过假孕动物的蜕膜，这就不可避免地排除了胚胎对蜕膜组织的影响。作者采用人体早孕期绒毛及蜕膜组织进行检测。发现A组80％蜕膜组织DNA电泳出现200 bp左右的梯形条带，说明了蜕膜细胞凋亡在胚泡植入及胎盘形成过程中发挥作用。细胞凋亡在机体代谢、组织更新、激素作用器官的萎缩中发挥重要作用。但凋亡异常，包括抑制或过度，又是一些疾病发生的原因^［5］。本实验B组DNA片段分析结果，蜕膜及绒毛组织均出现细胞凋亡，且蜕膜的DNA碎片多于A组，推测B组蜕膜凋亡程度强于A组。即自然流产者的绒毛及蜕膜组织出现凋亡异常(凋亡过度)。这为从分子水平探讨流产、不孕的机制打下基础。

文献报道^［6］细胞凋亡发生必须有死亡基因的激活。本实验在正常早孕蜕膜细胞凋亡过程中并未发现有p53基因表达，可能与p53作用具有细胞类型及刺激特异性有关，并不是所有形式的凋亡均需p53参与。而本实验B组中p53在绒毛及蜕膜组织细胞凋亡过程中均有表达。提示自然流产可能是由于某种原因启动了p53基因。这为探讨将p53基因产物做为自然流产以至不孕症等疾病的生物学标志，利用p53单克隆抗体对疾病进行生物学治疗提供了基础资料。

细胞凋亡是一种由细胞毒淋巴细胞(cytotoxic T cell, CTL)及自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)杀伤靶细胞引起的细胞死亡^［7］。Rouvier提出CTL细胞对靶细胞的杀伤需要靶细胞上有Fas基因表达，而CTL细胞表达Fas配体(Fas-L)，二者相互作用引起凋亡^［7］。Fas与Fas-L可以在同一细胞或不同细胞中发挥作用^［4］。本实验Fas-L组织学表达结果分析，正常绒毛及蜕膜组织中均有Fas-L表达，推测表达Fas-L的滋养细胞与蜕膜细胞接触时，发挥CTL作用；蜕膜细胞上表达的Fas^［8］传递这种凋亡信号，从而引起蜕膜细胞凋亡，同时，蜕膜细胞本身也有大量Fas表达，也可引起自身凋亡。Fas-L的过度表达亦可引起蛋白从细胞表面脱落，进入细胞间隙或体液中，这种可溶性配体可以主动与 fas结合引起凋亡^［4］。说明不与滋养细胞接触部分的蜕膜细胞也会发生凋亡。关于表达Fas-L的蜕膜细胞是否会对绒毛的滋养细胞产生毒性作用，尚在探讨中。Kig a报道^［9］，妊娠前3个月，人类滋养细胞能抵抗CTL及NK细胞袭击，而其它组织不能。分析这种抵抗的原因，有两种可能：(1)绒毛滋养细胞表面无Fas表达，不能传递凋亡信号；(2)滋养细胞是否有其它基因，如Bcl-2基因表达，阻止了Fas介导的死亡信号。结合本实验在正常妊娠组绒毛组织中并未发现细胞凋亡现象这一结果推测：正常妊娠早期，在妊娠维持过程中，蜕膜细胞未对绒毛的滋养细胞产生毒性作用。

本实验B组10例绒毛、蜕膜组织的Fas-L阳性表达率为100％，且表达强度高，提示自然流产的绒毛及蜕膜组织出现了Fas-L的过度表达。引起自然流产的原因有多种，如染色体异常、母体因素、免疫因素等，是否均是通过启动新的基因表达，如TP53基因，或刺激某种基因过表达，从而引<