中国医学科学院学报2000年第22卷第3期

王岚叶惟三惠玲刘霄郭燕

摘要目的研究雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用机制。方法用雷公藤内酯酮200 μg/(kg^．d)喂服Wistar大鼠，8周后取材。做大鼠睾丸精子计数、精子活动度、睾丸切片的形态学观察，精核蛋白提取以及基因cyclin D1和Cdk4 mRNA的原位杂交实验。结果实验组大鼠睾丸精子数量为(26.43±3.90)×10⁶/g，比对照组大鼠的精子计数(41.15±5.51)×10⁶/g明显降低(P＜0.01)，精子活动度为(66.0±6.8)%，较对照组(88.0±2.0)%极显著降低(P＜0.001)；cyclin D1和Cdk4基因表达在精子细胞中显著上升。结论雷公藤内酯酮的雄性抗生育作用显著，作用机制可能主要是增加精子细胞cyclin D1和Cdk4基因的表达，抑制附睾精核蛋白的生物合成。

关键词：雷公藤内酯酮雄性抗受精作用cyclin D1Cdk4精核蛋白

近年来，药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii hook f，TW) 的男性抗生育作用受到国际社会的广泛关注，但其抗生育活性与抗炎、免疫抑制活性的不可分割却是一个重要缺陷^［1，2］。雷公藤的化学成分复杂，目前已从其中筛选、分离出7种单体，其中免疫抑制活性最低的是雷公藤内酯酮(triptonide)^［3］。本研究主要目的是对雷公藤内酯酮的抗生育作用机制进行探讨。

材料和方法

药品与试剂雷公藤内酯酮由中国医学科学院皮肤病研究所惠赠；含基因 cyclin D1 的载体质粒pGEM4，基因Cdk4的载体质粒SK，由美国冷泉港分子生物学实验室David Beach 博士惠赠；RNA 合成酶SP6、T3，内切酶 E.coRⅠ、SmaⅠ 购自 Promega 公司；地高辛标记和检测试剂盒购自Boehringer Mannheim 公司。

动物健康雄性 Wistar 大鼠共10只，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，体重为(190±10)g，分为两组，每组5只。Ⅰ组为雷公藤内酯酮实验组，雷公藤内酯酮用1%的二甲基亚砜(DMSO)配制，给药剂量为200 μg/(kg*d)。Ⅱ组为空白对照组，喂服1%的 DMSO，剂量为2 ml/(kg*d)。每周一称1次体重，根据体重调整喂药量，喂药8周后取材。雷公藤内酯酮组大鼠的合笼实验，已由江苏省计划生育研究所完成，结果见参考文献［1］。

大鼠体重及生殖器官的重量记录大鼠每周体重增加量，取材时分别称取大鼠睾丸、附睾、精囊腺的重量。

雷公藤内酯酮对大鼠精子的影响(1)睾丸内精子计数：约取四分之一睾丸称重，加蒸馏水研磨成浆，总量为1 ml。超声处理，计数每克组织所含的精子头部数目；(2)附睾精子活动度：取大鼠的双侧附睾，于生理盐水中剪碎，静置5 min，涂片计数300个精子中活动精子所占比例；(3)附睾精子银染^［4］：油镜下，随机计数200个精子，按形态分为4个等级：A.正常；B.精子头部异常；C.精子尾部轴丝分离或断裂；D.精子头颈分离；(4)睾丸组织切片：睾丸组织在Bouin氏固定液中固定，石蜡切片(片厚6 μm)，PAS染色。按照Russell等^［5］方法识别睾丸曲细精管14期，计数睾丸切片曲细精管第Ⅶ-Ⅷ期中的150个不同生精细胞(精原细胞、前细线期精母细胞、粗线期精母细胞、圆形精子细胞)与支持细胞的比例，支持细胞以看清核仁为准。

附睾精核蛋白的提取Fei法提取总碱性核蛋白(TNBP)^［6］，然后用Panyim法^［7］，在酸性-尿素系统中进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度为20%，结果拍成黑白照片进行灰度扫描，测得各蛋白条带的相对数值。

细胞周期蛋白基因cyclin D1、Cdk4表达mRNA的原位杂交(1)cRNA探针的制备：将含该基因的载体质粒pGEM4、SK cDNA用相应的限制性内切酶E.coRⅠ、SmaⅠ线性化，纯化；用RNA合成酶SP6、T3合成反义的RNA探针；按照地高辛标记和检测试剂盒提供的方法进行标记；(2)原位杂交：按文献［8］方法；(3)阴性组织对照：在实验条件完全相同的情况下，检测正常肌肉组织上述基因的表达；(4)阴性探针对照：在相同的实验条件下，以杂交液中不加cRNA探针和以正义cRNA探针代替反义cRNA探针，分别在曲细精管生精上皮和肌肉组织中检测上述基因的表达；结果拍照进行灰度扫描，测定管腔不同区域标记颜色的相对数值。

心肝肾的形态学观察(1)心肝肾组织琥珀酸脱氢酶组化反应，阳性反应为出现蓝紫色的颗粒沉淀；心肝肾组织ATP酶的组化反应，阳性反应为出现棕色颗粒沉淀；(2)取部分心肝肾组织Bouin固定，石蜡包埋切片，HE、PAS染色，光镜观察。

统计学处理实验结果以平均值±标准差(X±s)表示，组间比较用t检验。

结果

大鼠体重及生殖器官的重量变化喂药8周后，对照组大鼠和实验组大鼠的睾丸、附睾和精囊腺重量无明显差别(P＞0.05)。整个实验进程中，两组体重均无明显差别。

雷公藤内酯酮对大鼠精子的影响(1)精子计数：实验组大鼠的精子计数为(26.43±3.90)×10⁶/g，比对照组大鼠(41.15±5.51)×10⁶/g明显降低(P＜0.01)；(2)附睾精子活力：实验组大鼠的精子活动度为(66.0±6.8)%，较对照组(88.0±2.0)%极显著降低(P＜0.001)；(3)精子银染：实验组精子头颈分离的比例为(49.4±9.6)%，较对照组(19.0±5.2)%显著增多(P＜0.05)；(4)睾丸切片PAS反应：实验组和对照组都存在着正常的各阶段的不同组织和细胞，如血管、淋巴管、间质细胞和结缔组织细胞。实验组有第Ⅸ期精子的延迟释放现象，还可见空泡和细胞脱落，但数目不多。圆形精子细胞与支持细胞的比例实验组为(9.15±0.33)，比对照组(10.73±0.38)极显著下降(P＜0.001)，其它生精细胞的比例正常。

附睾的精核蛋白电泳结果对照组精核蛋白占总碱性蛋白的(40.6±7.2)%，而实验组为(4.6±2.2)%，较对照组极显著降低(P＜0.001)。

原位杂交实验结果光镜下可见在细胞核或细胞浆内有深蓝色cyclin D1或Cdk4 mRNA阳性杂交信号，且两者信号强弱基本一致。(1)正常组大鼠生精上皮中，cyclin D1在精原细胞和部分精母细胞中明显高表达，而圆形精子细胞则相对弱表达，在长形精子细胞和成熟精子中未见明显表达，cyclin D1 mRNA的信号主要存在于胞浆；Cdk4在正常大鼠生精细胞中的表达与cyclin D1相近；(2)cyclin D1在实验组大鼠生精上皮靠近管腔的精子细胞中出现异常的高表达，且cyclin D1 mRNA的信号主要存在于胞核；Cdk4在实验组大鼠生精上皮中的表达与cyclin D1相似(附图)； (3) 阴性组织对照示正常肌肉组织中上述基因基本无表达或微弱表达； 阴性探针对照示曲细精管生精上皮和肌肉组织中均未见阳性反应。

附图cyclin D1和Cdk4基因表达原位杂交相片的灰度扫描结果

fig Photographic gray level scanning of hybridization in situ of cyclin D1 and Cdk4 gene expression(*P＜0.001 compared with control)

大鼠心肝肾组织的变化心肝肾组织的琥珀酸脱氢酶、ATP酶组化反应结果全部为阳性，实验组和对照组无明显区别；心肝肾组织的石蜡切片HE和PAS染色结果均未见明显异常。

讨论

目前男性避孕药的研究重点以激素类药物为主，但非激素类药物，尤其是从雷公藤提取出的二萜类环氧化物(diterpene epoxide)系列也颇引人注目^［9，10］。本实验结果表明，雷公藤内酯酮显著影响雄性Wistar大鼠睾丸产生精子的数量以及附睾精子的活力；但对大鼠体重及各生殖器官重量影响不大；通过对大鼠心肝肾组织的组化和切片的形态学观察显示，雷公藤内酯酮对心肝肾组织无毒性损伤。以上结果表明雷公藤内酯酮在不影响机体脏器和生殖器官的剂量下，有显著的雄性抗生育作用，具有作为男性避孕药物的潜质。

在雷公藤内酯酮雄性抗生育作用机制方面，本研究发现实验组大鼠圆形精子细胞的比例较对照组明显降低，而精原细胞、前细线期精母细胞和粗线期精母细胞的比例均正常；第Ⅸ期曲细精管有精子延迟释放现象，且长形精子细胞数量明显减少。说明雷公藤内酯酮主要作用于变形前的圆形精子细胞，阻碍其向长形精子细胞分化。细胞如果不在分化状态，就会进入细胞周期。cyclin蛋白系列是细胞周期进程的正向调节子，它们通过激活一系列蛋白激酶，如Cdks(cyclin-dependent kinases)，并与之结合形成复合物行使其功能。通过cyclin蛋白系列的降解与不同cyclin基因表达及其蛋白的积累，激活不同的Cdk基因表达，细胞周期才得以进行下去^［11］。cyclin D1 结合并激活其主要的催化亚单位Cdk4和Cdk6，而它们通过使Retinoblastoma(Rb)肿瘤抑制蛋白和其它2个Rb相关蛋白p107、p130磷酸化，调节G₁期进程和G₁/S期的过渡^［12］。在哺乳动物中，Cdk4(在一些类型的细胞中是Cdk6)及其酪氨酸的磷酸化是从G₀期进入细胞周期所必需的^［13］，而cyclin D1和Cdk4对调控G₁期和DNA复制的开始是必需的。过量表达cyclin D1造成Cdk4基因也过量表达，可使细胞生长和增殖的速率异常^［14］。雷公藤内酯酮使精子细胞中cyclin D1和Cdk4基因表达显著增加，造成精