中国医学科学院学报2000年第22卷第2期

王子梅陆召麟郭爱丽

摘要目的建立阿片黑皮质素原(POMC)基因 5^′上游近端转录调控体系并初步探讨其作用特点。方法采用DNA重组技术构建一系列受大鼠POMC基因 5^′上游近端不同长度片段介导的荧光素酶报告基因质粒，以 lipofectamine 包裹质粒转染垂体ACTH瘤细胞系(AtT20)，然后测定荧光素酶活性。结果成功地构建了含POMC基因-34/＋63 bp、-165/+63 bp、-323/+63 bp和-480/+63 bp片段的4种报告基因质粒，其荧光素酶相对表达活性分别为1、2.1±0.3、3.3±0.3和3.7±0.5，阳性对照为4.8±0.8。结论POMC基因的核心启动子比较弱，提示POMC基因可能存在多个转录起始位点：AtT20细胞中POMC基因持续表达的近端组织特异性调控元件主要集中于-34/-165 bp范围内。上述结果为进一步研究各种调节因子对该基因的表达调控打下基础。

关键词：POMC基因AtT20细胞基因调控

POMC (阿片黑皮质素原)基因主要在垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞中表达，可生成ACTH，α、β、γ-促黑素、促脂素及β-内啡肽等一系列多肽。正常情况下，POMC基因接受下丘脑释放的促肾上腺皮质激素释放激素、肾上腺皮质分泌的糖皮质激素负反馈调控，同时也受多种细胞因子和神经肽调节；在垂体ACTH瘤中，POMC基因持续过度表达，反馈调控失效。因此，建立POMC报告基因转录调控体系并研究其转录调控特点，有助于直接揭示各种激素、细胞因子等对该基因表达调控的作用方式，并为阐明垂体ACTH瘤发病机制提供依据。

材料和方法

材料含有大鼠POMC(rPOMC)基因5′上游560 bp(-480/+63)序列的质粒JA300由加拿大Montreal 临床医学研究所Drouin教授馈赠。质粒pGL2-Basic、pGL2-promoter、大肠杆菌DH5α、限制性内切酶BglⅡ,BssHⅡ、HindⅢ、PstⅠ、StuⅠ、XhoⅠ及Klenow 大片段DNA聚合酶，T₄DNA连接酶、dNTP等分别购自Promega公司、Gibco公司、BioLabs等公司。［γ-³²P］-ATP购自北京亚辉同位素公司，fmol DNA循环测序系统购自Promega公司。AtT20细胞(小鼠垂体ACTH分泌瘤细胞系)具有POMC基因高表达和大量持续分泌ACTH激素及相关肽的特点，为本室保存细胞株。脂质体lipofectamine购自Gibco公司。荧光素酶测定系统、β-半乳糖苷酶(β-Gal,转染效率内参照)测定系统均购自Promega公司。

大鼠POMC基因5′上游近端片段与荧光素酶报告基因载体的重组和纯化^［1］用BglⅡ/HindⅢ酶切JA300质粒，回收560 bp大小的DNA片段(含POMC基因5′上游-480/+63序列)，将其定向克隆至荧光素酶报告基因载体 pGL2-Basic 质粒的 BglⅡ/HindⅢ 位点上，构建pGL2-POMC480质粒。在此基础上，以 POMC-480/+63 bp 序列中单一酶切位点StuⅠ、 BssHⅡ、 PstⅠ， 分别酶切删除 pGL2-POMC480 质粒中的 BglⅡ/StuⅠ、 BglⅡ/BssHⅡ 和 BglⅡ/PstⅠ 片段，先后经 Klenow 酶及 T₄DNA 酶补平自连，分别构建 pGL2-POMC323(POMC-323/+63)、pGL2-POMC165(POMC-165/+63)和pGL2-POMC34(POMC-34/+63)等3种质粒(图1)。其中，pGL2-POMC34只含有POMC基因核心启动子序列(包括TATA盒和转录起始位点)。用透析袋、Wizard^TM纯化系统及氯化铯超速离心法纯化上述重组质粒。

图 1重组质粒 pGL2-POMC480、pGL2-POMC323、

pGL2-POMC165、pGL2-POMC34的构建图

fig 1The strategy of construction of pGL2-POMCs

质粒酶切图谱分析按Promega公司提供的方法进行。

核苷酸序列测定采用双脱氧DNA链合成终止法^［1］。 以［γ-³²P］-ATP 末端标记 pGL2-荧光素酶报告基因公共引物，PCR条件为95℃变性 2 min 后进行下列程序：95℃变性 30 s，64℃退火 30 s，70℃延伸 1 min，循环30周。

细胞培养及质粒转染按Gibco公司提供的方法进行，将 AtT20 细胞按 1×10⁵ 个细胞/孔转入6孔培养板，加入含10%胎牛血清的 DMEM 培养基，培养24 h至细胞贴壁，换转染液(每孔 1 ml无血清不含青链霉素的DMEM培养基中含5 μl lipofectam-

ine、 1.2 μg各种pGL2-POMC重组质粒和0.8 μg β-Gal内参照质粒)，8～10 h 后换正常培养基，再培养 48 h 后，用Promega公司荧光素酶测定试剂盒中裂解液裂解细胞。

荧光素酶和β-Gal活性测定(1)荧光素酶活性测定：取20 μl细胞裂解液加入100 μl荧光素酶反应底物，在MonoLight-2010发光仪上测定荧光强度 。(2)β-Gal活性测定：取 50 μl细胞裂解液加入96孔板，加50 μl 2×测定缓冲液，37℃孵育30 min，酶标仪测定光密度(OD)值(波长 450 nm)值，同时设立标准曲线。以β-Gal活性值校正相应裂解液中荧光强度，并以“相对荧光素酶活性”表示该报告基因的表达活性。

荧光素酶相对活性的计算方法：每批转染实验设定pGL2-POMC34的荧光素酶活性为1，计算每份标本荧光强度值/β-Gal活性并与pGL2-POMC34相比得出相对值(n=3)，由3批独立的转染实验之间的均值再平均得出相对活性均值和标准差。

结果

重组质粒的酶切电泳图谱分析及核苷酸序列测定构建的pGL2-POMC480、pGL2-POMC323、pGL2-POMC165、pGL2-POMC34 4种POMC基因5′上游近端调控序列荧光素酶报告基因质粒，对其进行酶切电泳图谱分析表明，各种酶切片段大小与预期值相同(图2～5)。对pGL2-POMC480质粒进行核苷酸序列测定显示，其序列与有关文献报道一致，未发现碱基缺失或基因突变。

图 2重组质粒 pGL2-POMC480 的酶切电泳图谱

fig 2Restriction map of recombinant plasmid pGL2-

pOMC480

1. marker λ DNA/HindⅢ；2. pGL2-promoter (BgⅢ/HindⅢ)；3. JA300 (BgⅢ/HindⅢ)；4. pGL2-POMC480 (XhoⅠ/HindⅢ)；5. pGL2-POMC480 (BgⅢ/HindⅢ)；6. pGL2-POMC480 (StuⅠ/HindⅢ)；7. pGL2-POMC480 (BssHⅡ/HindⅢ)；

8. pGL2-POMC480 (PstⅠ/HindⅢ)；9. marker pBR322/BstNⅠ

图 3重组质粒 pGL2-POMC323 的酶切电泳图谱

fig 3Restriction map of pGL2-POMC323 recombin-

ant plasmid

1. marker λ DNA/HindⅢ；2. pGL2-POMC323 (KpnⅠ/HindⅢ)；3. pGL2-POMC323 (XhoⅠ/HindⅢ)；4. pGL2-POMC323 (BssHⅡ/HindⅢ)；

5. pGL2-POMC323 (PstⅠ/HindⅢ)；6. pGL2-POMC323 (HpaⅠ/HindⅢ)；7. pGL2-POMC323 (BamHⅠ/PstⅠ)；8. pGL2-POMC323 (EcoRⅠ/KpnⅠ)；9. marker pBR322/HinfⅠ

图 4重组质粒 pGL2-POMC165 的酶切电泳图谱

fig 4Restriction map of pGL2-POMC165 recombin-

ant plasmid

1. marker λ DNA/HindⅢ；2. pGL2-POMC165 (KpnⅠ/HindⅢ)；3. pGL2-POMC165 (XhoⅠ/HindⅢ)；4. pGL2-POMC165 (PstⅠ/HindⅢ)；

5. marker pBR322/HinfⅠ；6. pGL2-POMC165 (HpaⅠ/HindⅢ)；7. pGL2-POMC165 (KpnⅠ/EcoRⅠ)；8. pGL2-POMC165 (BamHⅠ)；9. marker λ DNA/HindⅢ

图 5重组质粒 pGL2-POMC34 的酶切电泳图谱

fig 5Restriction map of pGL2-POMC34 recombin-

ant plasmid

1. marker λ DNA/HindⅢ；2. pGL2-POMC34 (HindⅢ)；3. pGL2-POMC34 (KpnⅠ/XbaⅠ)；

4. pGL2-POMC34 (XhoⅠ/HindⅢ)；5. marker pBR322 HinfⅠ；6. pGL2-POMC34 (HpaⅠ/HindⅢ)；7. pGL2-POMC34 (KpnⅠ/EcoRⅠ)；

8. pGL2-POMC34 (BamHⅠ)；9. marker λ DNA/HindⅢ

转染质粒的荧光素酶相对表达活性设定pGL2-POMC34质粒转染AtT20细胞的荧光素酶表达活性为1，则pGL2-POMC165的相对荧光素酶表达活性为2.1±0.3；pGL2-POMC323的相对荧光素酶表达活性为3.3±0.3；pGL2-POMC480的相对荧光素酶表达活性为3.7±0.5<