中国医学科学院学报2000年第22卷第2期

刘金毅孟雁赵晓娟沈洁薛越强史顺娣蔡有余

摘要目的同时克隆EcoRⅡ限制性内切酶基因(ecoRⅡR)和EcoRⅡ甲基化酶基因(ecoRⅡM)，初步探讨该限制-修饰系统的协同表达机制。方法采用外切酶Ⅲ删除法构建单向缺失亚克隆，根据亚克隆的酶活性对上述两种基因进行初步定位，经核酸序列测定确定亚克隆的缺失部位，再以S1核酸酶保护分析法测定基因的转录起始点。结果克隆片段上含完整的ecoRⅡR基因和ecoRⅡM基因，ecoRⅡR基因有两个转录起始点；ecoRⅡR基因3′端132 bp→ 458 bp和ecoRⅡM基因3′端202 bp为表达活性所必需，一个基因的编码区及旁侧序列的缺失并不影响另一基因的表达，仅有ecoRⅡR基因表达的缺失体对dcm⁺的宿主有致死作用。结论ecoRⅡM基因的有效表达对系统的维持是至关重要的，控制ecoRⅡR基因与ecoRⅡM基因表达顺序的关键可能不在转录水平上。

关键词：EcoRⅡ限制性内切酶EcoRⅡ甲基化酶缺失突变基因表达

EcoRⅡ限制性内切酶(EcoRⅡ R)和EcoRⅡ甲基化酶(EcoRⅡ M)构成E coli R的一个限制-修饰系统，它们与大肠杆菌中广泛存在的DNA胞嘧啶甲基化酶(Dcm)在DNA上有相同的识别序列CCWGG。 EcoRⅡ R在该序列上的切割受到EcoRⅡ M和Dcm甲基化作用的阻止。EcoRⅡ R是第一个被发现的需要底物上至少有两个识别位点才能产生有效切割的Ⅱ类限制酶^［1］，EcoRⅡ M与细菌中诸多甲基化酶以及真核生物的胞嘧啶甲基转移酶结构和性质相似^［2］，因此，EcoRⅡ 被作为研究核酸酶结构及其与DNA专一性作用的理想分子。

虽然各限制-修饰系统的功能相同，胞外酶活性相似，但在分子遗传水平上却是十分多样化的。ecoRⅡ R基因和ecoRⅡM基因的克隆和测序均已见报道^［3～5］，但关于两种基因的整体表达及其与宿主携带的dcm基因的表达关系仍不清楚。本研究对同时克隆的ecoRⅡR和ecoRⅡM基因进行序列鉴定，分析结构基因及旁侧序列不同区域的缺失对基因表达的影响，探讨不同表型的突变体对宿主的选择性。

材料和方法

菌株和质粒E coli HB101(hsdR^-， dcm⁺)由本研究室保存，E coli JM110 (hsdR^-，dcm^-)为中国科学院上海生化所惠赠，pBluescritpⅡ SK+ 为Stratagene公司产品。

主要试剂限制性内切酶购自华美生物工程公司，S1核酸酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4寡核苷酸激酶及外切酶Ⅲ顺序缺失系统试剂盒均为Promega公司产品，T7 Sequence^TM试剂盒为Pharmacia公司产品，其他试剂均为国产分析纯级。

ecoRⅡR基因和ecoRⅡM基因表达的检测参见文献［6］。

单向缺失亚克隆的构建构建方法按照Promega公司提供的试剂盒说明书进行。在克隆片段的两端分别选择限制酶SacⅠ切点和KpnⅠ切点作为缺失起始点(抗外切酶Ⅲ的降解)，克隆片段经外切酶Ⅲ从两个方向删切，载体自连后转染dcm⁺的宿主菌HB101，筛出的克隆经单酶切后按其大小排序。

序列测定和分析采用Sanger法进行双链DNA模板测序，手工测序按照T7 Sequencing^TM试剂盒说明书进行。聚丙烯酰胺测序胶的制备方法参照文献［7］，在377测序仪(ABI)上进行自动测序，新序列的分析采用计算机程序UWGCG。

S1保护分析法测定转录起始点细菌全RNA的提取采用Brosias等^［8］改进的方法。含ecoRⅡR基因预测启动子区的ApaⅠ-AccⅠ(382 bp)片段，经小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后，用［γ-³²P］ dATP和T4寡核苷酸激酶标记5′端，利用DNA两条链6个碱基的长度差别，通过5%聚丙烯酰胺变性胶分离双链，回收单链探针。将25 μg全RNA 与DNA探针混合于20 μl杂交液［40 mmol/L PIPES (pH 6.4)、1 mmol/L EDTA(pH 8.0)、0.4 mol/L NaCl、 80% 甲酰胺］中，85℃变性后，37℃保温 16 h将混合物加至200 μl S1核酸酶消化液［0.28 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaAc (pH 4.6)、 4.5mmol/L ZnSO₄、 20 μg/ml变性鲑精DNA、500 U/ml S1 核酸酶］中，30℃消化75 min。消化产物与已知的测序反应物同时以8%聚丙烯酰胺变性胶进行电泳，放射自显影检测被保护片段的大小。

结果

ecoRⅡ R/M基因的克隆从E coli R中分离出一 50 kb 的质粒，转化HB101菌后的细胞粗提液能对λDNA产生限制性降解，该质粒的酶切图谱与携带ecoRⅡR/M基因的pN3相同。质粒经ClaⅠ和PstⅠ联合酶解，与相同酶解的pBluescript SK+ 连接后转化HB101菌，获得一个具有限制酶活力的含3.7 kb外源片段的重组子，再转化JM110后证实，上述克隆同时含有可表达的甲基化酶基因(命名为pSKRM3.7)。

单向缺失亚克隆的构建及ecoRⅡR/M基因的初步定位从克隆片段的SacⅠ端用外切酶Ⅲ删切后，筛选出16个预期大小的亚克隆，依次编号为pS1、pS2……pS16，平均每个亚克隆间相差220 bp。从KpnⅠ端删切得到7个部分连续的亚克隆，编号为pK1、pK2和pK11……pK15(3～10号未获得预期大小的克隆)，连续克隆之间平均相差230 bp。通过检测各亚克隆的基因表达活性表明，ecoRⅡR基因和ecoRⅡM基因被初步分别定位在距PstⅠ0.2→1.4 kb和1.5→3.3 kb之间(图1)。

核苷酸序列测定和分析选用M13反向引物和M13-20正向引物对两套亚克隆进行核苷酸序列测定，拼接后获得克隆片段全长序列。分析结果表明：3 655 bp的克隆片段上含完整的ecoRⅡR和ecoRⅡM基因，编码区与文献报道一致；对新获得的ecoRⅡR基因上游375 bp和ecoRⅡM基因上游615 bp的旁侧序列(结果未显示)经计算机软件分析，未发现第3个可能与两基因协同表达有关的小控制读框(Open Reading Frame control, ORFc)。结合全序列分析显示，缺失体pS1、pK1和pK2仍保留了完整的ecoRⅡR基因和ecoRⅡM基因的编码区和启动子区，启动子区上游序列的删除不影响两个基因的表达；缺失体pS2→pS7已删除ecoRⅡR基因的启动子区和部分编码区，但未损及ecoRⅡM基因。pS8删除了ecoRⅡM基因3′端202 bp，则丧失了抗EcoRⅡR 酶切割的能力；pK11删除了ecoRⅡR基因3′端458 bp,则使基因表达活性丧失。

图 1pSKRM3.7缺失突变体的构建及ecoRⅡR/M基因的定位

fig 1Construction of pSKRM3.7 deletion dirivatives and localization of the ecoRⅡR/M genes

ecoRⅡR基因转录起始点的确定采用S1核酸酶保护分析法测定了ecoRⅡR基因准确的转录起始点。细菌mRNA与覆盖表达调控区的单链DNA探针杂交后，用S1核酸酶消化未杂交部分，反应混合物与一套已知测序反应产物同时电泳。结果显示，被mRNA保护的DNA探针片段大小为93 bp和94 bp(图2)。由此推断ecoRⅡR基因的转录起始点位于翻译起始码上游-39和-40位的两个腺嘌呤处(图3)。

图 2ecoRⅡR基因转录起始点的S1核酸酶分析结果

fig 2S1 nuclease analysis of the transcriptional start site of ecoRⅡR gene

t, C, G and A lanes: from a known sequence reaction; 1. protected fragment of 93～94 bp after S1 nuclease treatment

图 3ecoRⅡR 基因转录起始点的位置及对调控元件的不同推测

fig 3The transcriptional start site of ecoRⅡR gene and the different predicted elements** transcriptional start site - from Bhagwat^［5］… from Kossykh^［4］

讨论

EcoRⅡ具有Ⅱ类R-M系统典型的酶学作用，但在分子遗传水平上极为特殊。所有已克隆到的R-M系统的R基因和M基因都是紧密连锁的^［9］，其中大多数系统的两个基因由相同的DNA链转录，这种组成易于保证M基因先于R基因表达，以避免杀伤宿主。ecoRⅡR基因和ecoRⅡM基因由不同的DNA链尾对尾方向转录，其协同表达作用更为复杂。

编码区不同区域的缺失可分析酶分子不同肽段的功能，本实验用外切酶Ⅲ构建了两套ecoRⅡR/M基因的单向缺失突变体。Kupper^［10］报道EcoRⅡR碳末端44个氨基酸的缺失并不影响该酶与底物的特异性结合及酶切活力。本实验在筛选ecoRⅡR基因3′端缺失突变体过程中发现，直至被删除458 bp后，因限制酶活力的丧失才得到活菌克隆(pK11)，说明EcoRⅡR碳端44→152氨基酸对维持限制酶活力是必需的。Posfai J^［11］等分析了多种5-胞嘧啶甲基化酶后认为，这类酶的碳端275个氨基酸与识别特异性有关。本研究中的pS8仅缺失ecoRⅡR基因3′端202 bp即丧失了抗EcoRⅡR酶特异切割的能力，说明EcoRⅡM碳端67个氨基酸是识别特异性所必需的。

决定R-M作用顺