中国人兽共患病杂志2000年第16卷第3期

李爽甘绍伯彭瑞云高亚兵熊呈琦王德文

摘要：观察原位PCR方法在弓形虫感染病原学检测中的效果。以RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第2、4、6天处死，取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本，以直接法原位PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫DNA，与免疫组化方法检测冷冻切片标本的结果相比较。18例直接原位PCR法检测标本中均得到阳性信号，病原体检出率为100％，优于免疫组化法（11／18）。直接法原位PCR为检测病理标本中的弓形虫DNA提供了一种新的可行方法。

关键词：弓形虫病理检测原位PCR

弓形虫病是一种世界范围的寄生虫病，免疫功能抑制患者重要的机会性感染病原^［1］。由于其临床表现不典型，造成确诊困难，以病理诊断为甚。原位PCR作为一项新的分子水平的形态学研究方法，近几年受到了重视^［2］。该法可将PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合，在组织细胞原位检测到特定DNA或RNA序列的同时对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。本文即采用直接法原位PCR，检测感染小鼠肝脏标本中的弓形虫DNA，并与免疫组化法检测结果进行了比较，以探讨此方法在弓形虫病病理诊断中的意义。

1材料与方法

1.1动物模型的建立以本室保存的RH株弓形虫感染小鼠（昆明小鼠，雌性，体重18～22g，购自中国医学科学院动物繁育所），每鼠腹腔接种弓形虫速殖子2×10²个。

1.2待测标本的获得将感染小鼠每6只1组随机分为3组，于接种后第2、4、6天任选1组处死，按常规方法^［3］取每只小鼠的部分肝脏固定于10％缓冲福尔马林中，其余肝脏存入液氮。以同批未感染小鼠4只作为对照。固定后组织制备石蜡切片，厚度为7μm，（承载蜡片的载玻片需先涂布0.5mg／ml的多聚赖氨酸）。并于58℃烤箱内烤3～5天后存入4℃备用。每份标本作常规HE染色。

1.3直接法原位PCR

1.3.1引物及试剂根据文献^［4］设计特异性扩增弓形虫B1基因的一对引物。

引物1：5－GGAACTGCATCCGTTCATGAG－3，

引物2：5－TCTTTAAAGCGTTCGTGGTC－3。

引物由美国CyberSyn公司合成（经RPC）纯化，扩增产物长194bp。Taq DNA聚合酶购自Promega公司，四种三磷酸核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）购自军事医学科学院（进口产品分装），生物素标记的dVTP（Bio－ll－dVTP）购自北京医科大学，蛋白酶K为Merck公司产品，牛血清白蛋白（BSA）为中科院上海生化所产品，ABC检测试剂盒为美国VECTOR LABORATORIES，Inc产品，DAB显色系统购自北京中山生物技术有限公司。

1.3.2仪器实验所用的原位PCR扩增仪为美国PE Cetus公司生产的PE 1000型原位PCR扩增仪。

1.3.3标本预处理取存于4℃的感染小鼠肝脏及正常小鼠肝脏石蜡切片标本常规脱蜡、水化，经稀酸（0.2N HCl）酸化处理，以蛋白酶K（0.1M Tris－HCl，pH8.0，50mM EDTA，pH8.0）配制，工作浓度为50μg／ml）于37℃消化15min，以0.2％甘氨酸终止反应后经乙醇逐级脱水，风干备用。洗涤液为TBS。

1.3.4原位扩增预处理后的标本置于PE公司与原位扩增仪配套的专用封片机上，在热启动（94℃）条件下滴加PCR扩增反应液，封片后在PE 1000原位扩增仪上扩增。反应总体积为50μl，含有10mM Tris－HCl（pH9.0，25℃），50mM KCl，0.1％ TritonX－100，2.5mM MgCl₂，3μg／ml BSA，引物各1μM，Taq酶4U，dATP、dCTP、dGTP各200μM，dTTP160μM及50μM的Bio－11dUTP。反应参数为：94℃变性7min，三温循环为94℃ 2min，60℃ 2min，72℃ 3min。循环次数30，末延伸72℃ 7min。

1.3.5原位检测原位扩增后经充分洗涤，并经无水乙醇后固定。检测前经过3％H₂O₂破坏内源性过氧化物酶并用正常血清封闭，按试剂盒说明滴加ABC复合物并用DABT系统在室温下显色，自来水冲洗终止反应。

1.3.6结果判定显色终止后以苏木素染液复染，并按常规脱水、透明、封片。镜检阳性结果呈棕黄色。每次实验均设立无Bio－11－Dutp、无Taq酶、无引物以及检测系统对照，同时以正常小鼠肝脏标本作为已知阴性对照。

1.4免疫组化检测以存于液氮中的小鼠肝脏组织制备冰冻切片，厚7μm，弓形虫阳性兔血清（本所免疫）1∶400稀释，HRP－SPA（本所标记）工作浓度为1∶8 000，底物溶液购自军事医学科学院，直接镜检阳性结果为蓝色。

2结果

2.118例弓形虫感染小鼠的肝脏标本经直接法原位PCR后，镜下均可检测到阳性标志。

每次实验所设之无Bio－11－dUTP、无Taq酶、无引物及检测系统对照均为预期结果，在未受感染之小鼠肝脏标本则未检及阳性物。

在感染后第2天处死的6例小鼠肝脏标本中，阳性信号多见于肝窦中的血细胞内及邻近的细胞中，呈现出弓形虫随血行播散的特点。感染后第4天，阳性信号呈小片状见于肝脏内各处，沿肝窦及汇管区多见。在感染后第6天，直接法原位PCR的阳性信号极多，分布在肝窦、汇管区、坏死灶等处，在肝内血管旁及肝被膜下的坏死灶处，阳性信号可以清晰地显示出虫体的增殖情况，并可见到单个包囊样结构。见图1。

图1原位PCR对小鼠肝脏感染弓形虫的检测显示

fig.1The result of in situ PCR

2.2经免疫组化检测，感染后第2、4、6天各组小鼠肝脏标本的阳性检出数分别为3、3、5，总检出率（11／18）低于原位PCR法（18／18）。

2.3经常规HE染色，感染后第2天小鼠肝脏标本中未见明显阳性结果，感染后第4天、第6天小鼠肝脏标本中可见到坏死灶，分别在5例（第4天）及6例（第6天）标本中见到弓形虫疑似物。

3讨论

1990年，Haase等^［5］用PCR扩增绵羊脉络丛细胞中感染的Visna病毒DNA，并用原位分子杂交的方法检测，创立了早期的PCR原位分子杂交技术。Nuovo等^［6］继之在1991年应用此技术显示了宫颈鳞状上皮中人乳头瘤病毒DNA的分布。此后，这一技术被许多实验室成功应用。

原位PCR分为直接法和间接法两大类。直接法原位PCR的特点是使扩增产物直接携带标记分子，在扩增体系中使用放射性同位素³⁵S、生物素和地高辛精等标记的三磷酸核苷酸或引物，根据标记物的性质检测扩增产物。这种方法操作上相对简便，流程较短、较为省时。但有文献报道在石蜡切片标本上该法假阳性问题总是较为严重^［7］，因此，我们在实验中设立了多种必需的对照检测，结果表明，按照本文所建立的直接原位PCR方法，此一系列严格的对照试验均无意外结果出现，该方法可以成功地应用于检测感染小鼠肝脏组织中的弓形虫DNA。

由于原位PCR操作步骤较多，在实验室内完成这一方法需在标本制备、预处理、原位扩增、后处理和原位检测各基本步骤加以注意。其中最为重要的是以适宜条件对标本进行预处理。本文在处理小鼠肝脏切片标本时，对比了几种不同消化时间，确定以50μg／ml的蛋白酶K溶液，37℃作用15min结果最好。

利用直接法原位PCR，我们在感染弓形虫2、4、6天的小鼠肝脏标本中均检出了特异的弓形虫DNA，与免疫组化法相比（感染后2天检出3例，第4天检出3例，第6天检出5例），该法不仅提高了检出例数，而且尤在感染后的早期检出中反映出差异，表明在感染程度较轻时，原位PCR法具有一定的优越性。鉴于弓形虫病患者感染程度通常明显轻于实验室感染动物模型，因此，在临床病理诊断中，原位PCR方法可作为一种新的有效的手段。

一般认为，在原因不明的淋巴结肿大病例中，有8%～15％是因弓形虫感染引起，但仅从淋巴结的病理组织学图像诊断弓形虫性淋巴结炎是不可能的^［8］。与常规HE相比，原位PCR方法可以将低含量的弓形虫DNA原位扩增后加以特异性显色，在光镜下直接判定结果，在保持组织学图像的同时检出外源感染，有利于明确由感染所造成的特异性的病理改变。关于此点，还有待于进一步深入研究。

本研究得到北京市青年科技骨干培养基金资助。

李爽（北京热带医学研究所北京，100050)

甘绍伯（北京热带医学研究所北京，100050)

彭瑞云（北京热带医学研究所北京，100050)

高亚兵（北京热带医学研究所北京，100050)

熊呈琦（北京热带医学研究所北京，100050)

王德文（北京热带医学研究所北京，100050）

参考文献

1，Lnft BJ，et al.AIDS commentary.Toxo plasmic encephalitis［J］.J In