中国骨伤2000年第13卷第1期

朱建民金宗达王萍花吴驿

关键词：基因疗法骨科

基因疗法是指将外源性基因转移到个体以达到治疗疾病的目的。早期设想是将基因疗法作为一种补偿机制治疗遗传性疾病。近年来，采用基因转移方法将基因疗法作为一种药物转移系统（drug-delivery system）可治疗获得性疾病^［1］。首例基因转移成功是一个标记基因（即不是以治疗疾病为目的，而是显示基因转移成功于否）。在美国，人类基因转移疗法是在1988年由美国国家卫生研究所重组DNA咨询委员会（the recombinant DNA Advisory Committee of the National Institutes of Health）批准实施的。1990年美国人将一个标记基因转移到黑色素瘤患者体内；1991年，第一个治疗基因（therapeutic gene，即期望产生治疗效应的基因）转移到T-淋巴细胞以矫正腺苷脱氨酶缺乏症。到目前为止，重组DNA咨询委员会已批准了80多例基因转移病人的临床研究，其中约50例正在世界各地实施中。尽管基因疗法还没有治疗骨科疾病的临床研究，但1993年6月，重组DNA咨询委员会则批准了2例治疗Gaucher′s病的临床研究；1994年6月，该委员会又批准第3例采用基因转移到类风湿关节炎患者关节内的临床研究，这些都为基因疗法在骨科的应用具有了可能性^［1］。

1 基因转移的载体

基因疗法有两大基本系统，即基因转移系统和基因表达—调节系统。除极少数外，裸体DNA一般是不能进入细胞并进行良好表达的，这种能使细胞摄取遗传物质和表达遗传信息的作用物质叫载体（vector）。基因载体分为病毒和非病毒（non-viral delivery system）两类，病毒是非常有效的载体，当病毒用作载体时，病毒基因组的一些成份通常要被切除，并被一些插入基因所替代。这种附加基因还可防止病毒感染靶细胞后大量增殖引起病理改变，从而使病毒载体设计成只能传递遗传物质到靶细胞的细胞核内，并无其细胞毒作用^［2］。

逆转录病毒（retroviruses）和腺病毒相关病毒（adenoassocited viruses）是病毒载体的两种类型，它们可通过感染将自己的遗传物质整合到细胞的DNA中去。逆转录病毒是基因疗法中最有发展前途的病毒载体，现已用于许多临床研究^［3］。目前，采用特殊细胞株可获得每毫升大于10⁶有用滴度的重组病毒产品，以供临床研究使用。然而，逆转录病毒载体也有一些缺点，包括（1）大多数逆转录病毒可诱导Moloney鼠白血病病毒；（2）逆转录病毒基因组太小，最大限度只能接受8000个额外核碱基，不适合于基因编码大分子量蛋白质和多个基因；（3）由于逆转录病毒基因插入到宿主细胞NDA的部位是随机的，当病毒顺序进入宿主基因细胞敏感部位时有可能诱发突变，可导致肿瘤基因激活和肿瘤抑制基因功能丧失，从而诱发恶性肿瘤；（4）逆转录病毒载体最大缺点是不能转导到不分裂细胞内，只有在细胞分裂时病毒DNA才能进入细胞核内^［3］。

腺病毒相关病毒不具有逆转录病毒载体的上述限制^［4］，它们是一类细小DNA病毒，人们可获得每毫升10¹⁰以上非常高滴度病毒。它们是非致病性病毒，将它们的DNA插入到宿主细胞基因组某个单链时，可作用于人染色体^－19顶点的特异部位。腺病毒相关病毒载体的最大优点是能感染不分裂细胞，目前已有报告它们能很好地将基因转移到神经细胞^［5］和气道上皮细胞，从而显示采用腺病毒相关病毒载体可治疗神经退行性病变和囊性纤维病。腺病毒相关病毒载体的缺点包括（1）它们很难增殖成为高滴度重组病毒，且重组病毒DNA顺序可被外源性DNA所替代；（2）重组病毒可失去将自身DNA插入宿主细胞基因组特异部位的能力；（3）这些小颗粒病毒限制了它们最多只能携带大约4000碱基的外来DNA。

腺病毒是一类非整合性病毒，它们感染细胞后不将自己的遗传物质插入到细胞的染色体上，在非整合附加基因存在的条件下，其DNA包含在细胞核内，因而它们是最有发展前途的非整合病毒载体，目前已用于对囊性纤维病的基因疗法研究中^［6］。重组腺病毒很容易获得高滴度病毒，并对分裂和不分裂细胞都具有很高的感染率。腺病毒载体的缺点有（1）转移基因的表达可随时间的推移迅速减低；（2）如果其DNA包含在附加基因中便丧失表达能力；（3）腺病毒蛋白质具有抗原性，可刺激免疫系统攻击腺病毒感染细胞^［7］。

单纯泡疹病毒是正在发展的另一种感染不分裂细胞的病毒载体，其基因组很大，理论上可携带大片段外源性DNA。但与腺病毒一样，单纯泡疹病毒载体也具有细胞毒性和临时性基因表达等问题。其他病毒包括乳头状瘤病毒，猿猴病毒－40，多瘤病毒，牛痘病毒，细小病毒（picornavirus）和某些其他病毒也正在作为基因载体研究中。

非病毒载体通常比病毒副本容易研制，其具有很大的化学稳定性；还由于它们不含有外来蛋白质和其他强烈的抗原物质，所以通常可反复使用。目前临床上已用于囊性纤维病和黑色素瘤基因治疗研究。其他非病毒载体—DNA配体复合物也正在研究中。非病毒载体利用细胞表面特异受体使目的DNA进入细胞，并促使细胞摄入核内^［8］。肝细胞表面具有丰富的无唾液酸糖蛋白受体，因而可采用DNA—聚赖氨酸—无唾液酸糖蛋白复合体来轰击肝细胞。这种受体介导摄入的基因表达非常有效，通过掺合腺病毒蛋白将增加基因表达^［9］。

裸体DNA只能在极少数细胞中进行转移和表达，包括骨—肌肉细胞、皮肤细胞和甲状腺细胞等^［4］，其中皮肤和骨—肌肉细胞中表达时间最长，甲状腺细胞基因表达半衰期只有40小时。注射DNA到兔膝关节内也可导致滑膜组织临时性基因表达^［10］。

在缺乏有效的细胞摄入DNA的条件下，采用基因枪通过微粒射击的方法也可使基因强行进入细胞内。早先人们只介绍采用基因枪将DNA射入植物细胞内，近年来的体内和体外研究显示，基因枪也可将要转移的DNA射入人细胞内。黄金微粒（particles of gold）大多为1～7微米大小，表面包上DNA后使其加速到很高速度，这时包着DNA的黄金微粒可有效地穿透细胞膜并转染细胞。有人报告，基因枪射入的基因其表达水平是很高的，但持续时间不长。

2 基因转移的方法

基因转移有两个基本方法，即外源基因通过载体直接进入体内，或在体外将靶细胞用外源基因转染后再植入体内。前者称谓直接（体内）基因转移法；后者称谓间接（体外）基因转移法。采用体内方法转移基因的技术相对简单，而体外方法则复杂得多，但却有许多优点。首先，当靶细胞分离出来后，可在试管控制下操作，没有病毒颗粒或DNA复合物注入体内。此外，采用体外转移基因的方法还有在体外选择高水平外源基因表达细胞的机会，这种选择作用是通过选择标记物基因连接和治疗基因的协同转导（co-transduction）来完成的，这种标记物基因的表达将使细胞抵抗某些物质，如Neo基因可抵抗新霉素，否则这些细胞将死去，而表达选择性标记物基因的细胞则可存活下来。因为选择性标记Neo基因可使得细胞抵抗新霉素和合成G418类似物，经过载体感染的阳性细胞可同时携带被转移的治疗基因和Neo基因。当细胞分裂时，那些不表达neo-基因的细胞将被G418物质杀死，幸存的细胞不仅有基因的表达，而且也能表达外源性的治疗基因。在G418物质存在的情况下，转染的细胞继续生长，从而可提供大量的携带的基因，遗传信息的选择性细胞克隆。在体外也可采用逆转录病毒将基因转移到细胞中去，包括软骨细胞、滑膜细胞和骨髓基质细胞等。一般情况下，这些细胞在体内分裂很慢，在体外丝裂原作用下则常可出现分裂^［2］。

采用体内或体外基因转移方法将目的基因固定到病变或其他部位，若基因产品进入全身循环称谓全身性基因疗法，若基因产品仅作用于病变部位称谓局限性基因疗法。前者适用于累及多器官或多系统病变的治疗，但副作用较大；后者常适用局部单病灶治疗，但副作用小。目前研究显示，用于全身性基因治疗有发展前途的细胞包括淋巴细胞、骨髓细胞、肌细胞、肝细胞、皮肤细胞和人工器官移植后出现在胶原中的转导细胞^［11］。

3 基因表达的调控

有效的基因转移到适当的靶细胞后还需要基因有一个适当的表达水平和时间，这就与基因表达和调节有关。尽管基因表达受到许多复杂机制的控制，但关键是特异基因启动子（promoters），它们不仅调节RNA的合成，从而影响基因转录，在许多情况下，大多可调节基因表达，但只适用于高基因表达水平，而且很快就会使基因表达能力丧失或中止。有人报告，在体内成纤维细胞中，采用逆转录病毒长末端重复启动子调节的基因大约1个月时间内失去表达能力^［12］，当它们在造血基质细胞中则可使基因持续表达好几个月。此外，病毒启动子在细胞停止分裂时常可丧失基因表达作用，这可能是由于甲基化酶的作用，使细胞内启动子胞嘧啶残端甲基化所致^［13］。

研究显示，一些真核细胞启动子具有延长和调节靶细胞基因表达作用，从而被称为管家基因（house keeping genes），但真核细胞启动子的表达水平一般都低于病毒启动子。因此，有人试图从病毒和哺乳动物启动子中设计出一种杂交启动子（hybird promoters）作为掺合调节成份，从而获得高效和长久基因表达功能。另外，真核细胞基因启动子也可用于组织特异基因表达，组织特异性启动子可包括肝细胞白蛋白启动子和关节<