国外医学病毒学分册2000年第7卷第2期

南京铁道医学院微生物免疫教研室（南京210009）潘宁（综述）张建琼（审校）

摘要本文介绍极限稀释法、bDNAR技术、竞争性PCR、Amplicor pCR 、Amplisensor PCR和荧光标记探针杂交PCR等六种核酸定量方法的基本原理，对其定量检测HCV rNA的敏感性、特异性、检测范围、重复性等进行比较，评价各方法的优缺点，并对HCV rNA的定量检测方法作一展望。

关键词：HCV RVA 定量 检测

1 HCV RNA定量意义

HCV RNA属于黄病毒家族正链RNA病毒，其感染的最大特点是极易演变为慢性。目前干扰素治疗是最重要的方法，但其费用昂贵，应答率低。因此了解病人体内的HCV rNA水平对于解病程度、特点是预测、评价干扰素治疗反应有十分重要意义，同时也使现丙型肝炎发病机制的研究进入量化阶段。

2 HCV RNA定量方法

2.1极限稀释法：使用nPCR或一轮PCR加同位素探针杂交法，理论上可测出低至一个模板的病毒，因此将阳性样品稀释直至靶基因不能再扩增，稀释度用于计算靶基因的分子数，可估计病毒绝对含量。

此方法尽管不需定量PCR的特殊设备，但影响因素较多，精确度难以保证，只能达到半定量，且操作复杂，每份标本需检测多个稀释度，费时费力，目前已基本被其它方法取代，仅在粗测或与其它方法结合时作用^［１,2］。

2.2竞争性PCR：在同一反应条件下，同一试管内同步扩增一段靶序列和另一段内参序列，作为竞争模板的内参靶序列使用相同的引物，并以相同效率扩增。扩增后，当二者的终浓度相同时，理论上其模板浓度也就应相同。将待测标本与十倍系列稀释的竞争模板混合，扩增后分别用各自的荧光探针杂交，在混合标本中目的基因和内参序列信号值相同时，待测标本浓度即为该份混合物中竞争模板的稀释浓度。

在HCV RNA检测中，必须构建RNA竞争模板，因为逆转录过程比cDNA扩增过程更能影响试验结果，因此使用DNA模板会导致结果不准确^［3］。竞争性PCR可排除从逆转录到扩增结束一切抑制因子，但一般不能说明RNA的抽提效率，因此也有人在标本中直接加入竞争模板^[4]。

在所有竞争性PCR方法中，系列稀释法被认为是精确度最高的，因此多为研究性实验室采用^［5,6］。但此法过于繁琐，每份标本必须和多个稀释度的竞争模板混合，多次PCR，杂交后才能定量。对此方法加以改进，将已知浓度的目的基因做十倍系列稀释，分别与固定浓度的竞争模板混合，扩增后杂交检测各标本中目的基因与内参序列的信号值，以目的基因的对数值为横坐标，目的基因与内参序列信号值之比取对数为纵坐标，制作标准曲线。将待测标本与固定浓度竞争模板混合PCR，杂交后比标准曲线上查得目的基因浓度^[7，8]。

有学者将所有竞争性PCR法做平行试验^[9]，发现所有方法的结果、敏感性、检测范围等均接近。他们还分别用异源竞争序列（仅引物结合部分序列相同）和同源竞争序列（仅和探针结合的21bP序列不同）作为竞争模板，证明二者无明显差异。

竞争性PCR定量检测HCV RNA可达到较高的精确度和敏感度（1000copis/ml），重复性也得到了提高。但扩增后的固相杂交等操作步骤繁琐，技术要求高，易造成产物污染，无法标准化，不利推广。

2.3 bDNA(branched DNA)技术：支链DNA（bDNA）技术是由Chiron公司推出的一种不依赖PCR的核酸放大定量方法，先将血清HCV rNA与包被在固相板上的探针杂交，固定后加入多个靶探针分别与HCV rNA5＇非编码区的核心抗原区的不同位点杂交，放大信号数十倍，然后加入bDNA扩增子，与各靶探针结合，每个扩增子提供多个酶探针结合位点，这样每个核酸信号得以放大数百倍。最后通过底物diexetane发光检测，发光是强弱与DNA量成正比。

bDNA技术最大的特点是不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高、用于HCV rNA的动态水平研究结果准确。该方法相对于竞争性PCR更易操作，只需将待检测病毒裂解使释放核酸，并将共变化为单链，即可进行检测，不需事先将其提纯化，因此已成为一种经典方法，受到广泛应用。有学者将其与竞争性PCR比较^[6]，发现虽然bDNA技术检测范围较窄，但其在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息，还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。但bDNA技术的局限性也显而易见，即放大倍数少、敏感性低、检测范围窄、不适用于HCV rNA的低水平检测，第一代bDNA技术的检测范围在3.5×10⁵～5.7×10⁷之间^[6],第二代bDNA技术的敏感性有所提高,可达2×10^5[1,10],但仍限制了该方法的应用。

2.4 Amplicor HCV Monitor^TM体系：Roche公司为满足批量检测的需要，建立了一种较为简便的HCV rNA竞争定量分析技术。该试验体系最主要的特点是步骤简单。血清HCV rNA采用极为简单的抽提程序，在一个试管内利用有逆转录和DNA合成双重功能的耐热菌（Thermus thermophilus,rTtH）DNA聚合酶进行反应，从而避免使用2个酶进行2次反应，采用dUTP代替利用dTTP,dUTP掺入DNA后，可被不耐热的脲嘧啶-N糖基酶（u-racil-N-glycosylase,UNG）裂解，含dUTP碱基的PCR产物被破坏。每次进行PCR前通过UNG的作用，使体系可能污染的PCR产物被降解，从而避免上一轮PCR产物的污染，UNG作用后高温灭活，又不影响此次扩增。此反应体系只需一组引物进行一轮PCR，通过下游引物5＇端生物素作用，利用微孔板杂交技术，以亲和素-辣根过氧化酶（HRP）系统显色，450nm测OD值，输入专用软件计算标本滴度。

Amplicor HCV Monitor^TM推出后，因其简便的操作、较高的敏感度（10³ copis/ml）^[10]、防污染等特性受到广泛应用。但该方法曲线范围有限，精确度和重复性也有待提高，而且大量报告显示^[10～14]，其检测值比竞争性PCR和bD-NA技术低十倍左右，这主要是因为简化RNA提取程度，丢失部分RNA所致。

竞争性PCR bDNA技术和Amplicor HCV monitor ^TM体系同为常用的HCV RNA检测方法。从敏感度来看，竞争性PCR（100%）＞Amplicor hCV Monitor^TM体系（90%）＞bD-NA技术（69%）^[15]，重复性bDNA最好^[14]，检测范围竞争性PCR＞Amplicor hCV Moni-tor^TM＞bDNA^[18]。以上三种各有利弊，检测低水平HCV竞争性PCR与Amplicor hCV Monitor^TM较为适用，又因Amplicor HCV Monitor^TM操作简便，更适于诊断。若要求HCV rNA绝对定量准确，则需采用竞争性PCR。同时竞争性PCR建立内参的设计思想可控制各环节对检测结果的影响，具有与更先进方法融合的潜力。bDNA技术优势在于相对定量精确，结果稳定，重复性高，多用于一定范围内动态水平检测^[6，16]。

2.5 Amplisensor检测系统：Amplisensor为美国Biotrnics tech公司推出的荧光定量PCR检测系统^[17]。其基本原理是根据荧光能量传递来检测两条互补配对核苷酸的双链结构。先进行一次不对称扩增，第二轮扩增时，双链信号引物的两条互补链上，分别标志荧光供体和受体，当信号引物处于双链结构时产生荧光。在PCR过程中，变性使引物荧光集团分离，复性时引物将优先与不对称扩增产物结合，使引物不再产生荧光。阻塞着PCR过程的继续扩增产物量越多，荧光减弱越多。每次试验均可加入标准HCV rNA和这空白对照，待测品与标准品荧光强度的减弱量比较后，通过配套软件进行数据分析，得出标本中HCV rNA的含量。

Amplisensor检测系统采用半巢式扩增和双链引物，特异性高，灵敏度与竞争性PCR相似，检测范围可达10³～10¹¹，整个过程半封闭进行，无须多次转移离心管，也不须传统电泳或杂交，既能进行大样本检测，又减少了污染机会，正得到国内日益广泛的应用。

Amplisensor检测系统是基于外参的定量技术，反应孔间差异可能导致准确性的下降，RNA提取，逆转录效率也可影响结果，另外较高的仪器和试剂费用也影响了该法的推广。

2.6 荧光标记探针杂交PCR：荧光标记探针杂交PCR方法现为定量检测低水平核酸的最新技术。该方法在普通PCR扩增系统中加入一个与靶序列特异性互补的双荧光标记探针，探针的5＇端标记荧光报告基因，3＇端标记荧光淬灭基因，探针完整时，由于淬灭基因的淬灭作用，报告基因不能产生荧光。扩增过程中，复性时，标记探针与靶序列互补结合延伸期，引物沿模板至标记探针结合处，Taq酶和5＇～3＇外切活性将探针5＇端报告基团切下，淬灭作用被解除，产生荧光。通过荧光光谱分析仪检测荧光强度，即可测得扩增产物量。

1995年，该方法首先用于单核细胞增生性李期物氏菌的检测^[18]。最近Matell等人将此项技术（Taqman roche）和ABI Prism7700（Perkin Elmer）实时序列检测技术结合，用于定量检测HCV rNA，并与bDNA技术进行了比较^[19]。

利用ABI Prism7700在PCR过程中同步检测荧光值，Martell等将荧光量增至扩增前10倍时所进行的循环数定为G_T点。PCR条件相同时，模板量越高，G_T值越低，G_T