中国医科学院学报2000年第22卷第1期

孙茂盛昝云红马雁冰张光明杜秋江戴长柏

摘要：目的用重组人腺病毒表达经修饰的轮状病毒VP4基因。 方法 RT-PCR扩增全长VP4基因，在基因5′末端引入信号肽序列，将带信号肽顺序的VP4基因插入 到含人巨细胞病毒启动子质粒中，然后克隆带巨细胞病毒启动子和信号肽的VP4基因到人腺 病毒5型转移载体上。用同源重组方法共转染293细胞，点杂交，酶谱分析筛选重组病毒。 结果 VP4全基因2 362 bp未发现突变。间接免疫荧光试验表明，重组腺病毒所表达的外源蛋白具 有 特异性和较强抗原性，蛋白印迹及免疫沉淀试验证明，表达的蛋白相对分子质量大于野生型 VP4蛋白，符合糖化后应有的相对分子质量，且这种糖基化蛋白可被特异性酶所消化。结论 提高重组蛋白的稳定性、抗原性，进行目的基因改造也许是一条有效的途径。

关键词：轮状病毒重组腺病毒糖基化作用

轮状病毒(rotavirus,RV)是无囊膜病毒，感染细胞后，以芽生方式进到细胞内质网中并 在其中装配成成熟的病毒颗粒^［1］。成熟的毒粒基因组含11个基因片段，分别编码不同的功能蛋白，VP4和VP7在诱导机体产生特异性免疫反应方面具有重要作用。与VP7不同，在毒粒装配前，VP4蛋白在胞质中合成，以非糖基化形式转入内质网参与毒粒装配，而VP7 在天然基因中含有信号肽顺序可直接进入内质网合成并获得糖基化。推测RV V P7蛋白在抗原性和免疫原性方面强于VP4抗原可能与蛋白糖基化有关^［2］。为了提高VP4蛋白的抗原性，对野生型基因进行修饰，在其5′末端引入一段信号肽序列，以模拟天然VP7基因在细胞中的合成方式使表达的VP4蛋白在信号肽引导下进入细胞内质网糖基化。以人或其它动物的病毒作载体表达外源基因已有广泛的用途 ^［3～5］。本实验选用人腺病 毒5型(hAdv5)-E1缺失型做表达系统，将修饰后的目的基因克隆到人腺病毒5型载体中，经同源重组获得含有目的基因的重组腺病毒(rAdv)，表达的蛋白具有高度特异性，并且在表达过程中获得了糖基化。

材料和方法

SA11毒株VP4全基因克隆用培养的SA11病毒，提取病毒基因组作为模板，经逆转录PCR(RT-PCR)扩增VP4全基因。反应分为逆转录和PCR扩增两个步骤。逆转录反应条件：总体积30 μl中含病毒dsRNA模板，正向引物5-AAGGCTATAAAATGGCTTCGCT，反向引物5-CGA-AGCTTGGTTTCTAGAAATT-3,10 U Rna si n,2.5 U AMV逆转录酶，42℃ 120 min。PCR反应条件，94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃ 90 s，30次循环后，延伸7 min，PCR产物经琼脂糖凝胶鉴定，循环仪为Perkin-Elmer Cetus。

野生型VP4基因的改造和重组质粒的构建扩增获得的VP4基因经限制性内切酶鉴定后，克隆到pUC18质粒中进行序列测定，选择正确顺序的VP4基因在其5′端引入一段来源于鼠免疫球蛋白的信号肽基因，构成能引导野生型VP4 基因到细胞内质网进行糖基化作用的嵌合型基因，将此嵌合基因插入到pCMV2质粒中，于巨 细胞病毒(CMV)启动子下游，然后克隆带有CMV启动子和信号肽的VP4基因到人腺病毒5型转移载体pXCX2，形成含有部分腺病毒基因组，CMV启动子，信号肽VP4基因及polyA的重组质粒(p XCX2/SGVP4)，经CsCl密度梯度离心纯化后用于同源重组(图1)。

图 1重组质粒的构建及其 同源重组

Fig 1Constructi on and homologous recombinant of recombinant plasmid

腺病毒基因组和重组质粒的制备纯化及共转染Adv5基因组和重组质粒均按常规方法转化大肠杆菌，碱变性法提取DNA限制性内切酶分析检 定。选择正确的基因组和重组质粒经CsCl密度梯度离心进行纯化。取20 μg纯化的重组质粒与5～10 μg基因组DNA用磷酸钙沉淀法转染293细胞，程序按文献［6］进行。293细胞在转 染前2 h弃生长液，换入新鲜完全培养液(10% CFS)。转染后 16～18 h弃培养液，换入新鲜的完全培养液，放37℃培养。

重组腺病毒的筛选及检定转染后的293细胞在37℃连续培养5～7 d，收集培养物，-70℃冻融3次，盲传。提取第3代培养物DNA用Adv5型基因组和RV VP4 cDNA片段作为基因探针进行点杂交筛选，选双探针阳性，最高稀释度阳性孔作为重组病毒种子。扩增病毒，提取病毒DNA，取1 μg DNA进行限制性内切酶图分析，同时做Southern杂交以确定VP4基因在重组腺病毒中的转录方向。

免疫荧光检测重组腺病毒感染MA104细胞14 h后弃生长液，用冷甲醇-20℃固定20～30 min。特异性抗体 为豚鼠抗RV SA11株VP4蛋白抗血清，程序按文献［6］进行。

蛋白印迹和免疫沉淀试验用重组腺病毒感染MA104细胞，14 h后弃维持液，用预冷的PBS洗3次，加入细胞裂解液［ Tris HCl pH 7.8,1 mol/L NaCl,0.5% NP40，Asprtion(蛋白酶抑制剂)］放冰上15～20 m in，分离上清与沉淀物。蛋白电泳，杂交程序按文献［6］进行。 免疫沉淀：单层MA104细胞用重组病毒感染14 h，弃病毒液用PBS洗两次，加入不含甲硫 氨酸的培养液(RPMI-Met^-)37℃ 20 min，按5 μl/ml加入³⁵S-甲硫氨酸(185 kBq/500 μl)37℃标记2 h，弃标记液，提取细胞蛋白，分别做免疫沉淀和糖苷内切酶E ndo H(0.1 U)和PNGase(0.06 U)消化的SDS-PAGE电泳分析^［7］。

结果

VP4全基因及腺病毒基因组特点RT-PCR获得的全长VP4基因共2 362 bp，经测序未发现变异。由于腺病毒基因组较大(3 6 kb)，因此在制备时转化菌生长慢，呈针尖斑，易变异，4℃及-20℃均不能保存菌种。

重组腺病毒生物学及基因组特性共转染盲传至第3代的293细胞，在第3天出 现细胞肿胀、变圆，光泽度增强、融合成团，整个细胞层呈网状，出现典型的细胞病理改变 效应(CPE)(图2)。重组病毒滴度可达10^7.0 TCID₅₀/ml，感染非支持型细胞后 不产生CPE。重组病毒置-20℃保存超过3个月后滴度明显下降，-70℃较稳定。病毒基因组较 稳定，经多次传代后，限制性酶切图谱分析未见变异。用PCR方法从重组病毒DNA中能扩增到 特异性产物。DNA酶切图谱、点杂交和Southern blot证明，在重组腺病毒基因组中含目的基 因并为正向转录。

图 2重组腺病毒感染293细胞3天后出现典型的病理改变效应

fig 2 Showed a typical cytopathogenic effect in a recombinant adenovirus infection 293 cells at 3 days p o stinfection

A.normal 293 cells control;B.infected 293 cell appear cytopathologi cal effect by a recombinant adenovirus

VP4基因在重组腺病毒中的表达间接免疫荧光检测表明，重组腺病毒(rAd/SVP4)感染MA104细胞(非支持复制型)14 h后， 在 细胞质内可见到强烈的特异性荧光灶，在对照细胞中均未检测到特异性免疫荧光(图3)。蛋 白印迹试验发现，在相对分子质量为102 000处有特异性杂交带，表明为VP4蛋白糖基化产 物(野生型为86 000～88 000) (图4)。免疫沉淀结果表明，未经消化表达的特异性 蛋白相对分子质量为102 000，而消化后相对分子质量为86 000～88 000(图5) 。

图 3重组腺病毒表达VP4蛋白抗原的免疫荧光检测结果

fig 3Results of immunofluorescence to expression of VP4 protein in a recombina nt adenovirus

A.normal MA104 cell control;B.specific antigen was determined by an ant i-VP4 antibody at 14 hours postinfection with the recombinant adenovirus(rAd/SV P4)

图 4重组腺病毒表达糖基化VP4蛋白的蛋白印迹结果

fig 4Result of Western blot to expression VP4 glycoprotein in a rAdv/SVP4

Mr:relative molecular mass;A.expressed VP4 protein by a recombinant Baculovi rus; B.expressed VP4 glycoprotein by rAdv/SVP4;C:expressed VP4 unglycoprotein by rAdv /VP4;D.normal cell control

图 5重组腺病毒表达VP4蛋白糖基化及其糖基化阻断免疫沉淀结果

fig 5Result of immunoprecipitation assay of expressed VP4 protein glycosylatio n and block in a rAd/SVP4

讨论 在基因工程疫苗研制中，如何增加表达产物的稳定性，提高其抗原性和免疫原性是值得深入 研究的问题。有些蛋白质在表达后由于折叠不正确或折叠效率