第四军医大学学报1999年第20卷第5期

韩军涛刘淑娟陈璧

摘要 目的：探讨苏拉明（suramin）对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长及代谢的作用．方法：利用细胞培养技术将成纤维细胞从瘢痕疙瘩组织中分离出来进行培养，分别利用绘制细胞生长曲线，测定细胞DNA合成代谢等手段来观察suramin对细胞生长及代谢的影响．结果：suramin 对体外培养条件下的瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长及DNA的合成均有明显的抑制作用，但对细胞的形态没有明显影响．结论：在体外培养条件下suramin可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长及代谢．

关键词：苏拉明成纤维细胞增殖

0引言

瘢痕疙瘩是由于组织创伤后异常修复所引起的，它的特点是瘢痕范围超过原皮损区域且可以向周边正常组织浸润，因此又被称为瘢痕瘤，它的治疗一直是临床上的一个难点^［1］．有研究表明，体外培养条件下瘢痕疙瘩成纤维细胞在细胞增殖及DNA合成代谢等方面均明显高于正常成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞，而且对多种生长因子的反应性亦明显高于后两者^［2～4］．最近人们在进行肿瘤的防治研究时发现suramin 能抑制多种生长因子的生物学作用，因此我们希望通过观察suramin对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用来初步探讨suramin的作用机制及在瘢痕治疗上的应用前景．

1材料和方法

1.1试剂 DMEM培养基，胰蛋白酶及胃蛋白酶均购自Gibco公司，人纤维蛋白原及Suramin购自Sigma 公司，小牛血清购自杭州四季青公司，³H-TdR购自中科院原子能物理研究所．

1.2瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代培养及传代取临床瘢痕疙瘩标本，无菌条件下剪去表皮及皮下组织，然后将组织标本剪成1 mm×1 mm×1 mm以下的组织块，贴附于培养瓶壁，37.0℃，50 mL/L CO₂孵箱中培养6 h～8 h后加入含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基继续培养，3 d换液1次，待细胞长出后即为原代成纤维细胞．当细胞达到80%融合时即可用2.5 g/L胰蛋白酶进行消化传代，实验用第3代～8代处于对数生长期的细胞．

1.3Suramin对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖情况的影响分实验组(T)，对照组(C)和空白组(B)3组．取第6代细胞消化并制成单细胞悬液，同时将人纤维蛋白原溶于三蒸水中，将两种溶液混合制成细胞-纤维蛋白原混悬液，使两者的终浓度分别为5×10⁷/L和2.5 g/L，按100 μL/孔接种48孔板，同时加入人凝血酶1 U/孔， 37.0℃，50 mL/L CO₂孵箱中孵育2 h之后每孔加入1 mL含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基继续培养．12 h后弃培养基，空白组加入无血清的DMEM培养基1 mL/孔，对照组加入新配制的含100 mL/L小牛血清的DMEM 培养基1 mL/孔，实验组加入suramin终浓度为300 mg/L的含100 mL/L小牛血清的DMEM 1 mL/孔，12 h后开始记数．以后每天于相同时间点换液并记数，连续12 d，依据所得数据绘制细胞生长曲线．此外同时观察细胞在suramin持续作用下形态的变化．

1.4Suramin对瘢痕疙瘩成纤维细胞DNA代谢的影响同上方法分组及接种细胞，于接种后24 h换液并进行 ³H-TdR掺入．每孔加入 ³H-TdR 37 kBq，然后37.0℃，50 mL/L CO₂孵箱中孵育12 h，取出后吸弃培养基，加入10 g/L胃蛋白酶及2.5 g/L胰酶各150 μL/孔，4.0℃冰箱放置24 h，镜下观察细胞均已消化后以多孔收集器收集于9999型纤维滤纸上，烤灯烤干后加闪烁液于Beckman 6500 型闪烁仪上测定各孔的cpm值．

统计学处理：实验数据均用x±s表示，并用Origin软件进行Student检验．

2结果

2.1细胞形态的观察瘢痕疙瘩成纤维细胞在立体培养条件下经suramin连续作用12 d，镜下未发现其形态有明显变化．

2.2细胞的增殖对照组细胞在整个观察期内均保持着较旺盛的增殖能力，空白组细胞的增殖能力弱于对照组，而实验组细胞的增殖则受到了明显的抑制，虽然存在着增殖现象，但速度缓慢(Fig 1 ).

图 1细胞生长曲线

fig 1The cell growth curves

2.3细胞的DNA合成代谢 实验组细胞的DNA合成明显低于空白组和对照组（P＜0.01），说明瘢痕疙瘩成纤维细胞在经suramin作用后其细胞的DNA合成明显受抑(Fig 2)．

图 2细胞的DNA合成

fig 2DNA synthesis of fibroblasts

3讨论

Suramin是一种水溶性的化学合成药物，其分子式为C51H34N6O23Na6S6，分子质量为1429.55 u，于1920年由德国首先发明并应用到临床，当时主要用来治疗非洲锥虫病及丝虫病．它的作用机制是可以与蛋白质结合形成稳固的化合物，从而干扰蛋白质的功能．由于它能和血清蛋白结合成复合物,因而其半衰期可长达3 mo^［5］．

近年来随着人们对肿瘤防治研究工作的深入，逐渐发现这一老药可能存在着广泛的应用前景．Hosang^［6］在1985年就发现suramin可以抑制PDGF所诱导的细胞的增殖和DNA合成，而对PDGF的膜细胞受体没有明显影响．Coffey等^［7］在1987年研究发现suramin在体外可以抑制一系列生长因子对鼠AKR-2B细胞的刺激作用，此外它还能抑制诸如补体系统，GTP酶，ATP酶等多种蛋白酶类的活性及反转录酶的活性．有资料表明suramin的抗肿瘤作用是通过阻断生长因子与其受体的结合来抑制肿瘤细胞的过度增殖，甚至可以将细胞因子从它与受体的复合物中解离出来，对于PDGF和TGF-β，T1/2时间约为 20 min左右^［8］．

瘢痕疙瘩作为组织异常修复的产物，与一般的增生性瘢痕不同，它具有类似肿瘤生长的特点，可以向周围正常皮肤浸润，且手术切除后复发率高，因此在临床上一直缺乏有效的治疗手段．我们通过实验研究发现，suramin在300 g/L时对瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长及DNA合成均有明显的抑制作用．我们认为其作用机制可能是suramin通过与培养基中小牛血清及细胞自身分泌的某些生长因子直接发生关系从而阻断或降低了它们对细胞的刺激作用的结果；此外细胞在整个观察期内形态并没有发生明显变化，也从另一方面说明了suramin可能对细胞本身不存在直接的作用和影响．

总之，我们的实验初步证实了suramin在体外可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长及代谢，为下一步研究suramin对细胞功能的影响奠定了基础

作者简介：韩军涛，男，1968-12-24生，山东省广饶市人，汉族，1993年第四军医大学毕业，1996年烧伤外科学硕士研究生，导师陈璧. Tel：(029)3375297

作者单位：第四军医大学西京医院：¹整形外科中心烧伤外科，²妇产科，陕西 西安 710033

参考文献

1 Murray JC,Pollack SV, Pinnell SR. Keloids: A review. J Am Acad Dermatol, 1981;4(3):461-468

2 Bettinger DA, Yager DR, Diegelmann RF et al. The effect of TGF-beta on keloid fibroblast proliferation and collagen synthesis. Plast Reconstr Surg, 1995; 98(5): 827-832

3 Younai S, Nichter LS, Wellisz T et al. Modulation of collagen synthesis by transforming growth factor-beta in keloid and hypertrophic scar fibroblasts. Ann Plast Surg, 1994;33(2):148-151

4 Russell SB, Trupin KM, Rodriguez-Eaton S et al. Reduced growth-factor requirement of keloid-derived fibroblasts may account for tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA， 1988;85(2):587-591

5 Goodman LS, Gilman A. The Pharmacological Basis of Therapeuties. United States: United States Pharmacopein second edition,1955:1230-1231

6 Hosang M Suramin binds to platelet-derived growth factor inhibits its biological activity. J Cell Biochem， 1985;29(1):265-270

7 Coffey RJ, Leof EB, Shipley GD et al. Suramin inhibition of growth factor receptor binding and mitogencity in AKR-2B cells. J Cell Physiol， 1987;132(1):143-147

8 Huang SS, Huang JS Rapid turnover of the platelet-derived growth factor receptor in sis-transformed cells and reveral by suramin． J Biol Biochem， 1988;263(21):12,608-12,611