国外医学分子生物学分册2000年第22卷第1期

周建军（综述） 吴才宠 丰美福^*（审阅）

摘要 本文简述了生物芯片技术的一般过程（包括制片、双色荧光检测）对于生物学研究的意义和目前业界的动向，指出生物芯片技术作为新一代生物技术的应用正带动生物迅速向信息化方向发展的趋势。

关键词：生物芯片遗传工程

生物科学正迅速地演变为一门信息科学。最明显的一个例子就是目前正在进行的HGP（human genome project)，最终要搞清人类全部基因组的30亿左右碱基对的序列，这将是多达上百万页印刷符号的巨著（3000w/p）。除了人的遗传信息以外，还有其它生物尤其是模式生物（model organism)已经或正在被大规模测序解密，如大肠杆菌、啤酒酵母、美丽稳杆线虫以及中国和日本科学家攻关的水稻基因组计划。光拿到生物基因组序列一级结构还远远不够，还必须了解其中基因是怎样组织起来的，又是怎样随发育调控和微环境因素的影响而在特定的时空域中展开其表达谱的，即我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学）^[1]，涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（及相应的质谱法测蛋白分子量）和生物芯片（Biochip)技术^[2]。它们的应用将提供更为巨量的而且更生动形象的生命活动数据和图景。

1 生物芯片一般概念

生物芯片，简单地说就是在一块指甲大小的有多聚赖氨酸包被的硅片上将生物分子探针以大规模阵列的形式排布，形成可与目的分子相互作用，交行反应的固相表面，在激光的顺序激发下标记荧光根据实际反应情况分别呈现不同的荧光发射谱征，CCD相机或激光共聚焦显微镜根据其波长及波幅特征收集信号，计算机分析数据结果。目前最成功的胩形成一定商业市场的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交^[3]。其实理论上允许几乎所有种类的生物分子作芯片上的探针，比如蛋白、糖、脂类和其它小分子。这种技术的特点是微量化、大规模、并行化和高度自动化处理感兴趣的生物样品，精细地研究组织细胞基因表达情况，了解各种状态下分子结构变异和分子病理过程，并为寻找合适的医药或疫苗，提供了极大的便利。

一般说来应用DNA芯片进行实验包括5个过程：生物学问题的提出和芯片设计；样品制备；生物杂交反应；结果探测；数据处理和建模。那么，DNA芯片是怎样制造出来的呢？各种不同的方法有什么优缺点呢？多种高技术的融合最终使DNA芯片走出设想，走向实用化，逐渐成为象计算机芯片对于计算机科学那样对于实验生物学家不可缺少的工具。

2 目前的DNA芯片制造技术

目前大致有3种制造技术，其背后各有相应的生物技术公司实体支撑^[4]。

2.1 照相平板印刷术（Photolithography)

由Fordor在Affymetrix公司发展起来。该技术结合了半导体待业的照相平板技术和DNA原位化学合成技术。在一块玻璃片上无光罩掩蔽区的光敏基团修饰的脱氧核苷酸取代，之后用光罩保护新的确定区域，再进行上述这过程，如此循环保护和偶联的过程最终在玻璃片上的不同点合成特征性的寡核苷酸。其主要特征是：①可在芯片上根据已知序列原位合成，省去了麻烦的样品处理过程；②使用合成试剂将芯片之间的差异减少到最小；③能得到高密度的阵列。所不足的是，光罩非常昂贵且设计和制造非常费时。目前，Affymetrix公司能在1.6cm²内集成40万个位点的寡核苷酸点阵，每一点可包括1000万条3´端固定的探针。如果将来能发展起抗酸技术，避免使用光罩，这种方法非常有竞争力。

2.2 机械打点法（Mexhanical microspotting)

生物样品通过虹吸作用载入加样针器，然后通过直接物理接触传送至芯片底物的固相表面。每一轮点击完成后，加样针被彻底冲洗以免交叉污染，然后再载入新的样品开始下一轮打点过程。全部操作由自动控制的机器人系统和多道打印头来完成。

该技术首先由Schena、Shalon和Brown在95年发展起来，Synteni公司完成商品化。主要优点是：保持样品原型，操作迅速，成本低廉，用途广泛。缺点是：样品必须预先合成，需要一系列的纯化及储存等后续过程；密度达不到类似照相平板印刷术的水平，现在可做到10000点cDNA/3.6cm²。不过经过改进的话，最终可在6.5cm²的范围内容纳100000个核酸位点，从而为从事基础研究的实验室广泛采用。

2.3 喷墨法（Ink jets)

生化样品加载入袖珍喷嘴（有压电感应装置），在电流控制下喷嘴的有序开放和关闭使得精确量的样品液体喷射在预设的底物位点表面（固定是一个琥珀酰酯代反应过程）。之后与机械打点法类似，喷嘴得到清洗后再加样，如此循环，喷出一系列的阵列来。优点：这种方法允许几乎用任何感闪趣的样品做生物芯片，包括cDNA、基因组DNA、抗体和小分子物质；无接触制片、压电式传送理论上允许高速高密度制备，目前可做到10000cDNA/cm²，非常适合于做基因组分析。

3 双色荧光检测

结果探测中最常用的双色荧光检测过程^[5]是荧光标记和杂交检测：

3.1 荧光标记

两个来源的样品总mRNA分别和1：10000（w/w)的已知量mRNA（如人乙酰碱受体AchR的mRNA,作为内标）做一轮逆转录反应，各以荧光素（fluorescein)和丽丝胺（lissamine）核苷酸类似物标记；然后两种标记产物等比例混合。

3.2 杂交检测

混合标记物与同一块芯片杂交，然后分别激发不同的荧光分子，根据波长分离激发光用两个光电倍增管接收。这样使得两个独立的杂交结果可比，将其内在的实验误差降至最低。

除了以上常用的检测方式外，还有一种思路上很新颖的方法，叫光纤DNA生物传感器微阵列（fiber-optic dNA biosensor microarray)，将生物传感器与微阵列的优势结合了起来。它是将合成的氰尿酰氯活化的寡核苷酸探针固定在直径200um的光导纤维的末端上（传感器敏感膜），然后若干固定有不同探针的光导纤维合成一束，形成一个微阵列的传感装置，其探针末端可以伸入样品溶液中，杂交的荧光信号由另一偶联的CCD相机接受。整个操作分析可以在5 min内完成。而且传感器敏感膜还可以经过洗涤后再生利用。这咱将传感器与微阵列结合起来的方法特别便于操作杂交分析不方便的环境和不具备激光共聚焦显微镜这样昂贵检测设备的地方，如临床检测诊断，对于普及并行的多基因分析有重要的意义^[6]。

4 DNA芯片的应用

生物芯片技术展现出巨大的应用前景^[7]从斯坦福大学Schena、Shalon和Brown在1995年《Science》上描述开始用cDNA微阵列探索性研究拟南芥基因表达方式进行数量监测的一篇文章中可以清楚地看到。

4.1基因表达方式的探测是研究特定组织特定状态在基因组水平基因差异表达功能的最有效方法

有关DNA芯片的文章第一次出现就是描述在此方面应用的魅力。其实结果是表达基因组在发育或病理活动中动态功能信息的。因此理论上，有10000个基因的人类基因组可在一张芯片上、一次杂交反应中观察到其在目的细胞的实际表达状态，包括表达与否，表达丰度，而且两种相关细胞的实验可在同一张片子上同时做出来，便于最小实验误差情况下比较二者细微差异（双色荧光检测）。这样将具体的分子信息与细胞的生理特征改变联系起来，极有可能以前所未有的速度提示生命活动过程的精细机制，并成批地进行功能克隆新基因或将“孤儿基因”与确定的生物学功能联系起来；另一方面为临床诊断、预后评价提供全新的标准模式，为新药设计提示的靶分子而且提供快速廉价的分析手段。

4.2 应用于定位克隆

小小的生物芯片就好象一个高度集成高度有序的分子库。简单快捷的操作将大大方便新基因的寻找，作为第三代遗传标记系统的单核苷酸多态生（single nucleotide polymorphysms,SNPs）标记的应用结合连锁分析将使这种能力充分发挥出来。

4.3 基因组文库作图确定重叠群克隆的排序

比如从20个啤酒酵母的基因组克隆里制备Cosmid DNA，用限制性内切酶Ear i切割，PCR扩增，荧光标记变性产生单链DNA，与256点的芯片杂交，将荧光强度标准化，相临克隆对的相关值由统计分析确定，最后根据模拟退火过程中相关分数，将10个产生最强信号的克隆连续依次排列。估计一个操作者一天能完成几百个克隆的作图。这项技术显示了以高度并行方式进行克隆作图进行大规模测序的乐观前景。

4.4 检测基因突变和多态性

这需要控制严格杂交条件。Haria用含96000簇寡核苷酸探针的GeneChip检测了BRCA1基因3.45kb的第11外显子所有可能的杂合子突变。在15个病例样品结果中，一个假阳性和8个单碱基多态性被发现。这样的话，有5592个碱基、22个外显子的BRCA1基因所有突变可由一<