中国医科学院学报2000年第22卷第1期

邓友平林晨张雪艳陈德权肖培根吴旻

摘要：目的探讨三氧化二砷(As₂O₃)对食管癌 Ec109 细胞系的生物学效应及细胞和分子机制。 方法通过四氮唑(MTT) 还原法检测三氧化二砷(As₂O₃)对食管癌 Ec109 细胞系存活率的影响 ，从形态观察、流式细胞仪分析、DNA 凝胶电泳、细胞凋亡原位检测(TUNEL)研究三氧化二 砷诱导食管癌 Ec109 细胞凋亡的情况，并以 Western blot 检测基因表达。 结果Ec109 细胞经 As₂O₃ 处理后，存活率明显降低。光学显微镜下可见到明显的凋亡细胞 ，在细胞周期 G1 期前有低于2倍体的凋亡峰；DNA 凝胶电泳显示出典型的凋亡特征：DNA 有规律断裂形成的梯状图谱，细胞凋亡原位检测发现 DNA 断裂，Western blot 检测表明 c -myc 基因的表达下降。 结论As₂O₃ 能诱导人食管癌 Ec109 细胞凋亡，并伴随 c-myc 基因的降调节。

关键词：三氧化二砷食管癌 Ec109 细胞细胞凋亡c-myc 基因

三氧化二砷(As₂O₃) 是我国传统中药砒石的主要成分。近年来的工作表明， As₂O₃ 用于急性早幼粒白血病 (APL)^［1～3］ 治疗具有良好的疗效，且对全反式维甲酸 (ATRA)治疗后复发的患者有效。 As₂O₃ 治疗白血病的基础是诱导细胞发生凋亡^{［ 4］}， 而 ATRA 治疗白血病的基础则是诱导分化，这是 As₂O₃ 对 ATRA 耐药患 者仍有疗效甚至效果更好的原因之一。1990～1992年中国恶性肿瘤死亡抽样调查显示，食管癌分别占我国和世界恶性肿瘤发病的第 5 位和第 7 位，世界上70%的食管癌均发生在我国 ^［5］， 目前食管癌 5年生存率还在 30% 以下。本实验以食管癌 Ec109 细胞为模型，研究 As₂O₃ 对其生物学效应及作用机制。

材料和方法

材料As₂O₃ 购自 Sigma 公司，用生理盐水配成 1 mmol/L 的贮存液，使用前用完全培养基 稀释到所需浓度。

细胞和细胞培养人食管癌 Ec109 细胞，由本院分子肿瘤学国家重点实验室保存。用 M199 培养基培养。

MTT 还原试验在 96 孔板中每孔接种 2500 个细胞，培养 1、3、5、7 d后，参考文献［6］方法进行 MT T 实验，用自动酶标检测仪 (Biokinetics Reader, Microplate EL312e M， 美国) 在 540 nm 处检测光吸收值，以(用药组吸光度 A/对照组吸光度 A)×100% 计算细胞的存活率。

细胞形态观察每瓶接种 1.0×10⁶ 个细胞，24 h后用不同浓度的 As₂O₃ 处理，每天用相差显 微镜观察并照相，记录用药组和对照组细胞形态变化。

流式细胞仪检测参考文献［6］方法进行，收集 As₂O₃ 处理前后的细胞， 70% 冷乙醇固定 24 h， 10 μg/ml RNase A 37℃ 温育 30 min后，加 PI 使其终浓度达 20 μg/ml， 暗处作用 0 .5 h以上。用流式细胞仪(Coulter, Epicus ELITE, ESP, 美国)检测，数据用 Multicy cle 分析软件分析。

DNA 提取和凝胶电泳按照文献［7］方法略加改进。

细胞凋亡的 TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling) 检测按细胞凋亡检测试剂盒 (Boehringer Mannheim 公司产)说明书方法进行。

Western blot 分析提取细胞处理前后的蛋白，用 BCA Protein Assay Kit (Sigma 公司)法定量。 80 μg 蛋白用 10% SDS-PAGE 分离，转移到硝酸纤维素膜 (Bio-Rad 公司)上，按照化学发光试剂盒 (Amersham 公司)说明杂交。

结果

As₂O₃ 对食管癌 Ec109 细胞存活率的影响1 μmol/L 以上的 As₂O₃ 可明显降低食管癌 Ec109 细胞的存活率，而且随着浓 度的增加和时间的延长，细胞的存活率逐渐降低，呈现明显的时间和剂量依赖关系(图1)。

图 1三氧化二砷(As₂O₃) 对食管癌 Ec109 细胞

存活率的影响

Fig 1Effect of on the viability of human esophageal cancer Ec109 cells

As₂O₃ 处理食管癌 Ec109 细胞的形态学变化As₂O₃ 处理食管癌 Ec109 细胞后，在相差显微镜下观察到细胞形态变化十分明显。 5 μmol/L As₂O₃ 处理 1 d的食管癌 Ec109 细胞的形态几乎没有变化；3 d后不少细胞变圆，且细胞数目明显减少，细胞质和染色质浓缩，细胞膜弯曲，并有由核碎裂形成的凋亡小体而显现典型的凋亡细胞形态；5 d后，凋亡细胞数进一步增加，多数细胞脱落而悬浮于细胞培养液中，少数细胞体积增大、膜破裂而呈细胞坏死状(图2)。

图 2相差显微镜下 As₂O₃ 处理 Ec109 细胞的形态变化

Fig 2Morphological changes in Ec109 cells exposure to As₂O₃

A. untreated Ec109 cells (control);B～D. Ec109 cells treated with As ₂O₃ (5 μmol/L) for 1, 3, 5 days, respectively

流式细胞仪检测结果不同浓度 As₂O₃ 处理 Ec109 细胞 3 d后，在细胞周期 G1 期前，出现明显的凋亡峰 ； As₂O₃ 2 μmol/L 处理 3 d时，凋亡峰便比较明显，而且凋亡峰值随着浓度的增加 而增加(图3)。

图 3As₂O₃ 处理的 Ec109 细胞 72 小时 DNA 含量分布的直方图

Fig 3DNA histograms from flowcytomytric analysis of As₂O₃

treated Ec109 cells f or 72 hours

AP: represented apoptotic cells

As₂O₃ 处理食管癌 Ec109 细胞提取基因组 DNA 电泳结果 不同浓度的 As₂O₃ 处理食管癌 Ec109 细胞后，基因组 DNA 凝胶电泳显现明显的梯状图谱。用 2 μmol/L As₂O₃ 处理食管癌 Ec109 细胞 48 h，即可呈现梯状电泳带，而用 5 或 10 μmol/L As₂O₃ 处理 Ec109 细胞时，梯状电泳条带更为清晰(图4)。

图 4 As₂O₃ 作用 Ec109 细胞 48 小时提取基因组 DNA “梯状” 电泳图谱

Fig 4Detection of DNA ladder in a agarose gel after Ec109 cells treated with 1， 2， 5， 10 μmol/L As₂O₃ for 48 hours

C. Control;DNA marker: M1. DNA/HindⅢ;M2. DNA/HaeⅢ;

1， 2， 5， and 10. As₂O₃ 1， 2， 5， and 10 μmol/L, respectively

细胞凋亡 TUNEL 检测结果未经 As₂O₃ 处理的食管癌 Ec109 细胞仅呈现红色荧光，而经 5 μmol/L As₂O₃ 处理 3 d的食管癌 Ec109 细胞大部分呈现表明细胞凋亡的绿色或黄绿色荧光。

As₂O₃ 对食管癌 Ec109 细胞 c-myc 基因表达的影响Western blot 分析发现，经 5 μmol/L As₂O₃ 处理不同时间，食管癌 Ec109 细胞中的 c-myc 蛋白表达受到抑制，且表现为明显的时间依赖关系，到 72 h几乎检测不到 c-myc 基因的表达( 图5)。

图 5Western blot 检测 As₂O₃ 处理的 Ec109 细胞中 c-myc 蛋 白的表达

Fig 5Western blot analysis of c-myc gene

expression in As₂O₃ treated Ec109 cel ls

β-actin： internal control;C. control

讨论

砷剂是有毒化合物。流行病学研究表明，砷剂是一种致癌剂，可引起皮肤癌、肺癌^{［ 8］}等。但低剂量