中华器官移植杂志2000年第21卷第3期

王良利邹萍胡中波

摘要目的研究Fas系统对外周血淋巴细胞的影响。方法将分离、纯化后的淋巴细胞进行单向混合淋巴细胞培养，用流式细胞术动态检测新鲜分离和激活后的T淋巴细胞表面Fas表达水平，并用DNA电泳和原位末端标记技术分别从定性和定量的角度观察Fas系统激活与否对混合培养后淋巴细胞凋亡率的影响。结果T淋巴细胞在被激活后Fas表达水平升高，加抗Fas单克隆抗体组的细胞凋亡率高于未加抗体的对照组(P＜0.05)。结论在体外用抗Fas单克隆抗体处理被特异性抗原激活的淋巴细胞可诱导其凋亡。

关键词：淋巴细胞抗原基因表达脱噬作用

为研究Fas系统对特异性抗原激活的淋巴细胞凋亡的影响，我们在体外利用混合淋巴细胞培养使外周血淋巴细胞激活，检测其Fas表达情况，并比较加抗Fas单克隆抗体(抗-Fas)和不加抗-Fas时淋巴细胞凋亡率有何不同，探讨在体外利用抗-Fas清除特异性抗原激活的淋巴细胞的可能性。

材料和方法

一、 单克隆抗体

鼠抗人Fas单克隆抗体、鼠抗人IgG1同型对照单克隆抗体及藻红蛋白（PE）标记的鼠IgG1同型对照单克隆抗体购自美国Pharmigen公司，PE标记的抗人CD3单克隆抗体购自美国Ancell公司，异硫氰酸荧光黄（FITC）标记的羊抗鼠IgG购自美国Sigma公司。

二、外周血淋巴细胞的分离与纯化

25份血标本来自健康志愿者，全血经淋巴细胞分离液分离后得到单个核细胞，置培养瓶中于37℃、5% cO₂下培养24h，取出悬液，即得较纯的淋巴细胞。

三、单向混合淋巴细胞培养

将刺激细胞加入含50mg/L丝裂霉素的RPMI 1640培养基中（1ml加入10⁶个细胞），于暗处37℃孵育30min，洗涤3次，将反应细胞按4∶1与刺激细胞混合，置培养瓶中于5% cO₂、37℃下培养，细胞培养液为含20%小牛血清的RPMI1640培养液。处理细胞前行台盼蓝染色，细胞活度＞95%。

四、CD95(Fas)/CD3双标记检测Fas表达率

分别于混合培养前、培养后第4d和第6d取5×10⁵个细胞，加入0.1ml磷酸盐缓冲液（PBS），其中含质量浓度为0.2g/L的NaN₃、40g/L的牛血清白蛋白(BSA)和10mg/L抗Fas抗体(预实验确定)，置冰上孵育1h后洗涤3次，加入0.1ml pBS(含1∶50稀释的FITC标记的羊抗鼠单克隆抗体和质量浓度为0.2g/L的NaN₃)，置冰上反应1h，离心，去上清液，加入250mg/L人IgG20μl，室温下放置5min，加入PE标记的抗-CD3 80μl，置冰上反应45min，洗涤3次，加入质量浓度为10g/L的多聚甲醛0.5ml，按流式细胞术操作规程进行检测，同时设立同型对照。

五、细胞的处理

实验组刺激细胞先用5μg/L 佛波脂（PMA）、0.5mg/L ionomycin刺激24h，洗涤后再与反应细胞混合培养，于第6d加入抗Fas抗体，终浓度为5mg/L，继续培养24h后进行凋亡的检测，对照组细胞按单向混合淋巴细胞培养步骤培养6d后取出，进行凋亡的检测。

六、DNA电泳

将处理后的细胞在-20℃预冷的无水乙醇中固定至少24h，离心洗涤后，取5×10⁵个细胞加入80μl柠檬酸缓冲液中(192份0.2mol/L磷酸氢二钠与8份0.1mol/L柠檬酸混匀，调pH至7.8)，置室温下反应30min，离心，取上清液加1/10体积的乙酸钠(pH为5.2)和2倍体积的无水乙醇，于-20℃沉淀2h，离心，空气中干燥后加入体积分数为0.25%的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）和2g/L核糖核酸酶A3μl，37℃水浴30min，加入2g/L蛋白酶K 3μl，37℃水浴30min，加入上样缓冲液，置含溴化乙锭(EB)的12g/L琼脂糖凝胶上电泳4h，紫外灯下观察并摄影。

七、原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡率

收集适量细胞，甩片后按试剂盒说明书操作。光镜下计数200个细胞中阳性细胞数。

八、统计学处理

测定值以均值±标准差表示，采用二样本均数t检验。

结果

一、激活前后T淋巴细胞Fas表达率的动态观察结果

新鲜分离纯化得到的淋巴细胞用Fas/CD3双标记检测，结果表明其中T淋巴细胞占（67.1±7.9）％，说明经贴壁去除单核细胞得到较纯的淋巴细胞。T淋巴细胞Fas表达率，培养前为（31.9±0.5）％，激活后第4d为（47.4±7.4）％，第6d为（55.2±1.4）％。

二、DNA电泳结果

培养后的细胞加入抗Fas抗体处理24h，用快速法抽提小分子量DNA，电泳后呈现典型的梯形条带，而未加抗体的对照组则无阶梯状条带。

三、TUNEL法检测细胞凋亡结果

实验组细胞凋亡率为（38.5±4.0）％，对照组为（6.2±1.4）％，两组比较，差异有显著性（P＜0.05）。

讨论

Fas抗原是新近发现的一种细胞表面受体分子，当它被其配体即FasL激活后向细胞传导死亡信号，引起细胞凋亡，抗-Fas能模拟FasL作用，诱导表达Fas抗原的细胞系凋亡。

本研究将两个免疫遗传背景不同的个体的外周血淋巴细胞在体外进行单向混合淋巴细胞培养，以期部分反映骨髓移植后移植物中成熟T淋巴细胞被宿主移植抗原激活的情形。结果表明，外周血淋巴细胞在被激活后Fas表达水平确有升高。由于T淋巴细胞和B淋巴细胞在受到各自特异性丝裂原刺激后，加入同浓度抗-Fas，两者凋亡率无明显差异^［1］，因此我们未将T、B淋巴细胞分开。实验过程中，实验组的刺激细胞先用PMA、ionomycin处理，再进行混合淋巴细胞培养，这是因为T淋巴细胞在PMA和ionomycin刺激下FasL表达增高^［2］。由于FasL和抗-Fas具有相同功能，因此刺激细胞用PMA和ionomycin处理后其表面FasL表达增高，协同抗-Fas的促凋亡作用。有文献报道Fas表达率在1周左右达到峰值^［1］，因此我们选择观察培养6d内的Fas表达情况，结果以第6d的Fas表达水平最高，这为加入外源性抗-Fas提供依据。加抗-Fas与否对细胞凋亡率有显著影响，说明抗-Fas能促进被同种异体抗原激活的淋巴细胞的凋亡，从而为去除T淋巴细胞提供新的思路。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（39770767)

作者单位：王良利（430022武汉，同济医科大学附属协和医院血液科）

邹萍（430022武汉，同济医科大学附属协和医院血液科）

胡中波（430022武汉，同济医科大学附属协和医院血液科）

参考文献

［1］Miyawaki t, Uehara T, Nibu R, et al. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulation in human peripheral blood. J Immunol, 1992,149:3753-3758.

［5］Suda T, Takahashi T, Goldstein P, et al. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell,1993, 75:1169-1178.