福建医科大学学报1999年第33卷第3期

林玲大野诚远藤登代志女屋敏正

目的：克隆人甲状腺特异性转录因子-1基因片段，为进一步从事分子甲状腺学研究打下基础。方法：采用RT-PCR法从人甲状腺组织RNA中扩增出甲状腺特异性转录因子-1基因片段（440～803 bp）；应用TA克隆技术对PCR产物进行分子克隆；EcoR I双酶解法鉴定重组体。结果：获得TTF-1 cDNA的阳性重组体（pCR^TMⅡ／TTF-1），经EcoRI双酶解表明克隆成功。结论：TTF-1基因的分子克隆可进一步研究TTF-1基因对甲状腺特异蛋白质基因表达调控作用。

关键词：甲状腺特异性转录因子分子克隆

甲状腺特异性转录因子-1（thyroid specific transcription factor,TTF-1）基因是调控甲状腺细胞分化及特异性功能维持的关键性分子^［1～3］。TTF-1基因表达可作为分化与未分化甲状腺癌的分子标志，TTF-1 mRNA表达异常与多种甲状腺病相关^［4］。作者已建立RT-PCR法检测TTF-1 mRNA水平^［5］，并用PCR-SSCP法检测发现甲状腺癌组织中存在TTF-1基因突变^［6］。为了进一步研究TTF-1基因结构与功能关系，笔者应用TA克隆技术，完成TTF-1第二外显子区363 bp片段的分子克隆，酶解鉴定证实目的克隆片段的真实性，现报道如下。

1材料与方法

1.1正常甲状腺组织手术切除孤立性甲状腺结节时获取周围的正常甲状腺组织，液氮快速冻结，保存于-80℃。

1.2试剂及酶类逆转录酶，Taq DNA聚合酶、限制性内切酶，为日本Takara公司产品。

1.3载体及菌种pCR^TMⅡ及感受态大肠杆菌(one shot E. coli competent cell)购自美国Invitrogen公司。

1.4寡核苷酸引物设计根据Ikeda等^［7］发表的序列自行设计引物^［6］

5'-引物A:5'-GGGACGTGAGCAAGAACATG-3'

3'-引物B:5'-TTGCCGTCTTTCACCAGGAC-3'

它们所对应的核苷酸位于第二外显子区440～803 bp，扩增片段长度363 bp。

1.5RNA的提取及逆转录PCR^［8］

用酸胍-酚-氯仿（AGPC）法提取RNA。以mRNA为模板，在20 μl 体积加入11单位逆转录酶进行逆转录，得到cDNA。以上述逆转录产物为模板，50 μl PCR反应体积含100 ng模板cDNA，1.5单位Taq DNA多聚酶及125 ng顺义及反义引物。PCR反应在DNA扩增仪（2400型，美国Perkin Elmer公司）进行，循环条件为94℃，30 s→60℃，1 min→72℃，2 min， 循环35次，扩增产物在0.5 μg/ml溴化乙锭的2％琼脂糖凝胶中电泳。

1.6PCR产物的分子克隆及酶解鉴定

新鲜PCR产物在T₄DNA连接酶作用下与pCR^TMⅡ载体连接形成重组体PCR^TMⅡ／TTF-1，然后转化感受态的大肠杆菌（one shot E. coli competent cell)，碱法提取质粒DNA，进行EcoR Ⅰ-EcoR Ⅰ双酶解，观察其电泳结果。

2结果

2.1RT-PCR扩增TTF-1-cDNA应用RT-PCR从甲状腺组织扩增出TTF-1 cDNA片段，特异性电泳带出现 在所预料的位置（363 bp，附图第2泳道）。

附图TTF-1 PCR扩增产物及重组体pCR^TMⅡ/TTF-1的酶解鉴定

M4：分子量标志（Φ×174-Hae Ⅲ），由上至下依次为1353，1078，872，603，310，281 bp；1:PCR扩增产物；2～7:重组体pCR^TMⅡ/TTF-1的EcoRⅠ双酶解。

2.2TTF-1基因片段的分子克隆及酶解鉴定应用TA克隆技术，获得重组质粒pCR^TMⅡ/TTF-1，经EcoRI消化，切出 插入片段的分子量大小与克隆前PCR扩增产物的分子量大小一致，理论值为363 bp，证实克隆成功（附图第3～8泳道）。

3讨论

TTF-1是一种表达于甲状腺、肺、脑的转录因子^［8］。1989～1994 年间，科学家们已成功地克隆了小牛、鼠、人的TTF-1 基因并鉴定了 其结构特征。TTF-1基因位于人染色体14q13，含有2个外显子及1个内含子。人TTF-1由371个氨基酸残基组成，与大鼠TTF-1 cDNA的核酸序列具有92.7％同源性^［7］。在甲状腺中，TTF-1能够活化甲状腺特异性蛋白质——甲状腺球蛋白（TG）、甲状腺过氧化 物酶（TPO）、促甲状腺激素受体（TSHR）基因启动子的转录活性。TTF-1所识别的碱基序列为5'-GNNCACTCAAG-3'。TTF-1经依赖cAMP 的激酶磷酸化后，其转录调节活性增强，表现为TTF-1与DNA结合的亲和力升高。磷酸化是在丝氨酸残基上进行，若用丙氨酸代替丝氨酸后，TTF-1与DNA结合的活性降低。若TG四个结合部位中二个部位的DNA序列发生变化则可剥夺TTF-1的结合功能及启动子活性。TTF-1对于甲状腺细胞分化表型的表达起着重要作用，不含TTF-1的FRTL-5 细胞株也无TG、TSHR的表达。将TTF-1 cDNA转染到甲状腺肿瘤细胞中可复苏肿瘤细胞对甲状腺球蛋白的表达能力。临床上报道先天性甲状腺球蛋白缺乏系由于TTF-1基因表达不足所致。尚有报道分化的甲状腺肿瘤组织具有TTF-1 mRNA表达而未分化的甲状腺肿瘤组织则未能检出mRNA。因此，TTF-1是调控甲状腺特异性蛋白质基因表达的关键性分子。

应用PCR-SSCP法检测32例甲状腺肿瘤组织及8例癌旁组织，发现2例乳头状甲腺癌组织存在TTF-1基因突变^［6］，推测TTF-1基因突变可能导致甲状腺特异蛋白质TSHR、TG或TPO基因表达异常。克隆TTF-1对于进一步研究甲状腺疾病的病因及发病机制具有重要意义。本文在体外从人甲状腺组织中扩增TTF-1cDNA，构建重组体PCR^TMⅡ/TTF-1、酶解鉴定证实所克隆片段含TTF-1基因序列,为进一步研究TTF-1对甲状腺疾病调控机制打下基础。 本实验应用TA克隆技术对PCR产物直接克隆，原理为PCR反应体系中Taq DNA聚合酶具有一种非模板依赖性的活性，能在双链DNA分子的3'末端添加一个A，故PCR产物的3'末端均带有突出的碱基A成为粘端，TA克隆技术正是利用Taq DNA聚合酶这种特性，对质粒载体pCR^TM Ⅱ进行人工改造，使载体的多克隆位点（multiple cloning site,MCS）的3'端带有突出的碱基T也成为粘端，根据T-A互补原理，PCR产物可直接连接到此载体上，形成重组体，经过转化，筛选鉴定，扩大培养和质粒抽提即可得到大量单一的带有目的基因的重组体。这种技术对PCR产物要求不高，不需纯化或修饰PCR产物，不需在PCR 引物中设计酶切位点，故简化了PCR产物的克隆过程。TA克隆技术简便、高效,是基因工程研究中非常有用的实验技术，被越来越多的分子生物学工作者所利用。

本文工作系第一作者作为日本川医学奖学金特别研究员在日本山梨医科大学第三内科研修期间完成（1995～1996年）.

作者单位：林玲福建医科大学附属第二医院内科（泉州362000）

大野诚远藤登代志女屋敏正日本山梨医科大学第三内科

参考文献

1Civitareale D,Longito R,Sinclain A,et al. A thyroid-specific nuclear protein essential for tissue-specific expression of the thyroglobulin promoter. EMBO J, 1989;8:2537

2Francis-Lang H,Price M,Polycarpou-Schwhanz M,et al. Cell-type- specific expression of the rat thyroperoxidase promoter indicates common mechanisms for thyroid-specific gene expression. Mol Cell Biol, 1992;12:576

3Civitareale D,Castelli MP,Falasca P,et al. Thyroid transcription factor-1 activates the promoter of the thyrotropin receptor gene. Mol Endocrinol, 1993;7:1589

4Fabbro D,Loreto CD,Beltrami CA,et al. Expression of thyroid-specific transcription factors TTF-1 and PAX- 8 in human thyroid neoplasms. Cancer Res, 1994;54:4744

5林玲，大野诚，远藤登代志，等． RT-PCR法检测甲状腺特异性转录因子-1 mRNA． 福建医科大学学报, 1997;31:450

6林玲，大野诚，远藤登代志，等． 甲状腺癌中甲状腺特异性转录因子-1基因突变的检测． 中华内分泌代谢杂志, 1999;15:117

7IKeda K,Clark JC,Shaw-White JR,et al. Gene structure and expression of human thyroid transcription factor- 1 in respitratory epithelial cells. J Biol Chem, 1995;270:8108

8Saiki RK,Gel DH,Stoffel S,et al. Primer-directed enzymatic amlification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988;239:487

9Lazzro D,Price M,de Felice M,et al. The transcription factor TTF-1 is expressed at the onset of thyroid and lung morphogenesis and in re