中华血液学杂志2000年第21卷第4期

佟莉贞区小冰赖冬波何丽雅詹军芳李兰娜张力

关键词：DNA扩增法葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症基因突变型急性溶血性贫血

我们采用滤纸干血斑DNA直接扩增法和限制性内切酶分析技术，检测了87例葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症患者5种常见的G6PD基因突变型，对各种基因型与其引起的急性溶血性贫血的临床关系进行了研究，以了解不同的基因突变型有无不同的临床结果。

病例和方法

1研究对象87例患者中男76例，女11例，年龄1.5个月～10岁，平均3岁，均是我院1993～1997年因急性溶血性贫血发作而住院的患儿，通过高铁血红蛋白还原率和G6PD测定（NBT法）确诊为G6PD缺陷^［1］。其父母均为居住在广东，无亲缘关系的广东籍人。

2临床观察指标及其测定方法①诱因：用药史或进食蚕豆史；②溶血持续时间：尿色改变（酱油样、浓茶样或红葡萄酒样尿）持续的天数；③溶血程度：通过测定入院后末梢血中血红蛋白的最低值来评价。

3标本的采集取溶血发作停止半年以上或临床贫血症状已缓解患者的外周血，直接滴于滤纸（S&S）上，形成直径约1cm的血斑。每个患者取6个血斑备用，自然晾干后置于-20℃冰箱保存。

4引物及限制性内切酶针对5种不同的基因突变型(G1376T,G1388A,G95A,G392T,G1024T,)设计5对特异性引物及相关的内切酶BfrⅠ,NedⅠ,MluⅠ,BanⅠ,MboⅡ(美国Promega公司产品,由台北荣民总医院质量研究部萧广仁博士提供)，序列从略^［2］。

5聚合酶链反应（PCR）用直径3mm的滤纸干血斑直接进行PCR扩增，干血斑先经甲醇/丙酮（1∶1）混合溶剂处理，置60℃烤箱使溶剂挥发，然后加入PCR所需的各种试剂（Taq dNA聚合酶除外）。95℃水浴10min，60℃水浴20min，最后加入Taq dNA聚合酶进行PCR循环。反应总体积30μl，各份的终浓度如下：dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.2mmol/L，MgCl₂2mmol/L,上、下游引物各0.2μmol/L，1×缓冲液（Taq DNA聚合酶厂家提供），1U taq DNA聚合酶（Promega公司产品）。PCR在DNA扩增仪（Hema 480）上进行：95℃1min，59℃1min，74℃30s，1个循环；95℃1min，58℃50s，74℃30s，33个循环；最后74℃延伸5min。取PCR产物5μl与1μl上样液混合，20g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察结果。

6PCR产物的酶切分析取5～10μl PCR产物，用适当的限制性内切酶（G1388A,NedⅠ；G1376T,BfrⅠ；G1024T，MboⅡ；G392T,BanⅠ；G95A,MluⅠ）按商品说明之缓冲液温度消化过夜，然后将消化产物以80g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察结果。

结果

1各基因突变型的发生频率87例G6PD基因突变型中，属于G1376T的30例（34.4%）,G1388A的28例（32.1%），G95A的6例（6.9%）,G392T的1例（1.1%）,未发现有G1024T基因型患者。另有22例不属于本组所检测的5种基因型，不列入本组研究范围。

2基因突变型与溶血诱因的关系30例G1376T基因型中药物诱发的占12例(40%）,蚕豆诱发的占14例(46%）；28例G1388A基因型中药物和蚕豆诱发的均占14例(50%）；6例G95A基因型中药物和蚕豆诱发的也是各占3例(50%）。上述基因型的溶血诱因的差异无显著性（P＞0.1）。

3基因突变型与溶血持续时间及溶血程度的关系G1376T、G1388A、G95A、G392T基因型溶血持续的天数分别是(4.32±1.77),(4.04±1.65),(4.00±1.00)和6d,G1376T与G1388A基因型溶血持续的天数无显著性差异（P=0.565）。G1376T和G1388A基因型血红蛋白含量分别是(59.1±13.2)g/L和(59.9±12.0)g/L，两者差异无显著性（P=0.126）。

讨论

本组87例G6PD缺陷病例中，G1376T、G1388A、G95A、G392T分别占34.4%、32.1%、6.68%和1.14%，未定型占25%，但未发现有G1024T基因型患者。本组和我国广西、台湾的资料表明，G1376T和G1388A构成了中国人G6PD缺陷的最主要的基因突变类型^［3］。

G6PD缺陷临床诱发急性溶血的主要原因是药物和进食蚕豆。在G1376T、G1388A和G95A基因型的患者中，两种诱因差异均无显著性,提示这些患者溶血的诱因与他们的基因型无关。

G1376T与G1388A基因型溶血持续的天数和血红蛋白含量差异均无显著性，提示这两种基因型患者溶血的程度差异无显著性。

应用滤纸干血斑标本的DNA扩增法检查G6PD缺陷，因收集标本容易，方法简单，准确度高，故适用于大量标本的流行病学的调查研究。

作者单位：佟莉贞（510120广州市儿童医院血液科)

区小冰（510120广州市儿童医院血液科)

赖冬波（510120广州市儿童医院血液科)

何丽雅（510120广州市儿童医院血液科)

詹军芳（510120广州市儿童医院血液科)

李兰娜（510120广州市儿童医院血液科)

张力（510120广州市儿童医院血液科）

参考文献

1，张之南，主编.血液病诊断及疗效标准.第1版.天津：天津科技出版社，1991.86-95.

2，唐东江，马燮琴，宋诚燕，等.干血纸片法用于广东人G6PD基因点突变筛查研究.中华血液学杂志，1998，19：189-191.

3，谢建生，龙桂芳，蒋南华，等.两种常见葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变检测及临床分析.中华血液学杂志，1995，16：179-182.