中国医学科学院学报1999年第21卷第4期

方芳曹清宋福津刘景生

摘要目的探讨吗啡长时作用下分化的人成神经瘤SH-SY5Y细胞中cAMP系统变化以及PKA对转录因子c-Fos的磷酸化调节。方法采用蛋白竞争结合法、酶活性测定法及同位素掺入法分别观察cAMP、PKA及c-Fos的变化。结果(1) 100 μmol/L吗啡作用2 min～36 h可使SH-SY5Y细胞cAMP水平呈双相变化：短时作用下cAMP水平降低，随着吗啡作用时间的延长，cAMP水平逐渐回升，至36 h时明显高于对照，这时加入100 μmol/L纳洛酮可诱发cAMP水平的反弹性超高现象。表明吗啡作用36 h可使分化的SH-SY5Y细胞产生类吗啡依赖样变化；(2) 吗啡长时作用下，胞质可溶相PKA活性也呈双相变化，而膜相PKA活性未见明显变化；(3) 吗啡作用36 h时，细胞c-Fos磷酸化水平显著降低，PKA抑制剂可抑制此作用；(4) 纳洛酮可抑制上述PKA活性及c-Fos磷酸化水平的改变。结论SH-SY5Y细胞cAMP-PKA系统的上调可能与吗啡依赖的形成有关，而且在吗啡依赖样细胞中PKA可能通过磷酸酶而使细胞c-Fos发生去磷酸化，从而激活某些基因的转录，这可能是吗啡依赖时细胞产生适应性变化的重要机制之一。

关键词：吗啡依赖蛋白激酶Ac-Fos 磷酸化

以往对于阿片类物质耐受和依赖机制的研究主要集中在阿片受体的变化上，如受体的数目和亲和力等，但是关于阿片类药物耐受和依赖的形成机制至今尚不清楚。近年来人们的注意力逐渐转向了阿片作用的受体后机制，其中细胞G蛋白活性、胞内第二信使和蛋白磷酸化过程的改变尤其引人注目。研究发现，胞内腺苷酸环化酶(AC)活性及cAMP水平随着吗啡作用时间的延长而呈双相变化^［1、2］。Collier等^［3］人认为，AC/cAMP水平的改变可能是产生吗啡耐受和依赖的生化基础。为进一步探讨产生吗啡依赖的机制，本研究观察了吗啡长时作用于分化的SH-SY5Y细胞过程中cAMP水平、cAMP所调节的PKA活性的动态变化、PKA对转录因子c-Fos的磷酸化调节。

1材料和方法

细胞SH-SY5Y细胞由美国旧金山加州大学细胞培养中心Ibrahim Tuet惠赠。

主要试剂硫酸吗啡(morphine sulfate, Mor.),为Puninsula公司产品；盐酸纳洛酮(naloxone hydrochloride, NAl.)、Histone ⅡA、ATP、cAMP,为Sigma公司产品；c-Fos兔IgG抗体(为c-Fos p62特异性抗体，与FosB、Fra-1或Fra-2无交叉反应)，为Santa Cruz公司产品。［γ-³²P］-ATP(18.5×10¹⁴ Bq/(mmol^．L),为北京市亚辉生物医学工程公司产品。³²P-磷酸盐(无载体，3.33×10⁸ Bq/ml),为北京原子能研究所提供。

SH-SY5Y细胞类吗啡依赖样模型的建立SH-SY5Y细胞用RPMI-1640培养基按文献［4］的方法培养，以4×10⁵个/ml细胞接种于6孔板或培养瓶，24 h后加入分化剂(RA)并使其浓度达到20 μmol/L。RA作用6 d后，换培养液，加入100 μmol/L吗啡，作用2 min～36 h,或PKA抑制剂(protein kinase A inhibitor fragment 6～22 amide) 50 μg/ml 作用36 h。收集细胞前加入10 μmol/L腺苷酸环化酶刺激剂(forskolin)作用15 min及磷酸二脂酶抑制剂(IBMX)1 mmol/L作用5 min，其中一组吗啡作用36 h后加入100 μmol/L纳洛酮作用10 min。药物作用完毕后，迅速弃去培养液，加入6%TCA 1 ml,用细胞刮棒刮下细胞移入试管，并用0.5 ml 2% TCA洗一次，合并两次TCA，超声进一步破碎细胞，4℃离心(3000 r/min, 15 min)。上清液采用竞争性蛋白结合分析法测定cAMP的水平。

细胞蛋白激酶粗提物制备：药物作用完毕，将细胞迅速置于冰浴中，加入预冷的缓冲液［25 mmol/L Tris、2 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L DTT、 0.1 mmol/L 蛋白酶抑制剂(leupeptin)、0.5 mmol/L 蛋白酶抑制剂(PMSF)、 50 mmol/L 巯基乙醇、0.25 mol/L蔗糖，pH7.4］。刮下细胞，超声破碎后于4℃以800 r/min离心10 min。再取上清离心60 min(4℃，100 000×g),上清液用于测定可溶相蛋白激酶活性，沉淀加入含0.3%Triton X-100的匀浆缓冲液(与初次缓冲液体积相同)，冰浴中溶解后，于4℃离心(100 000×g 60 min)，收集上清液用于测定膜相蛋白激酶活性。

细胞PKA活性测定按文献［5］方法进行。

细胞c-Fos磷酸化测定参照文献［6，7］的方法加以改良。最后从样品中取20 μl上清进行SDS-PAGE分析(5%积层胶，10%分离胶)。电泳结束后，进行染色、脱色及干燥，-70℃曝光2～3 d。以电泳带的黑度(经密度仪扫描测定)表示磷酸化的强度。

数据处理：数据以均值±标准误(X±SX)表示，采用单因素方差分析，组间差异比较用t检验。

2结果

SH-SY5Y细胞类吗啡依赖样模型建立人成神经瘤细胞SH-SY5Y在含分化剂RA的培养液培养6 d后分化，轴突明显增多，成为具有神经细胞特征的细胞。以100 μmol/L吗啡分别作用于分化的SH-SY5Y细胞2、10、30 min及 36 h时，胞浆cAMP呈现双相变化，再加入100 μmol/L纳洛酮后，胞浆cAMP水平出现反弹性超高(overshoot)现象(图1)。

图 1吗啡在不同作用时间对forskolin 刺激SH-SY5Y细胞引起胞浆内cAMP升高的影响及纳洛酮引起cAMP的反弹现象

Fig 1Time-course of effects of 100 μmol/L morphine on forskolin stimulated cAMP accumulation in differentiated SH-SY5Y cells, and naloxone induced cAMP overshoot. (X±SX, n=4)

P＜0.05, P＜0.01 compared to control at the same time

SH-SY5Y细胞形成阿片依赖样过程中PKA活性的变化在吗啡作用2 min～1 h过程中，胞浆可溶相PKA活性呈双相变化，但膜相PKA活性与对照组相未见明显变化(图2)。

图 2吗啡在不同作用时间对SH-SY5Y细胞胞浆内PKA活性的影响

Fig 2Time-course of effects of 100 μmol/L morphine on PKA activity of cytosol fraction of differentiated SH-SY5Y cells (X±SX,n=4)

P＜0.05，P＜0.01 compared to control at the same time

PKA对吗啡依赖样SH-SY5Y细胞c-Fos磷酸化的调节用³²P-磷酸盐孵育细胞，作胞内磷酸化测定结果显示，吗啡依赖样细胞c-Fos磷酸化水平比对照组明显降低，加PKA抑制剂组c-Fos磷酸化状态明显增强。纳洛酮给药组c-Fos磷酸化未见明显变化(图3)。

图 3吗啡及PKA抑制剂长时间作用于SH-SY5Y对c-Fos磷酸化的影响

Fig 3Effects of long-term morphine exposure and protein kinase A inhibitors on c-Fos phosphorylation in cultured SH-SY5Y cells

(A) Lane 1: control; Lane 2: Mor+Nal;Lane 3: Mor; Lane 4:Mor+PKA-I； Lane 5: molecular weight standards. (B) The band corresponding to Mr62 000 c-Fos on autoradiograms was analyzed by scanning densitometry. Results from three separate experiments are presented (as X±SX)； P＜0.05,P＜0.01 compared to control; ^## P＜0.01 compared to morphine group; AU: absorption unit;Mor:morphine; Nal:naloxone；PKA： protein kinase A inhibitors

3讨论

本实验显示，分化的SH-SY5Y细胞，在吗啡长时作用过程中细胞cAMP水平呈双相变化。这与Yu^［4］和Carter^［7］的研究结果类似，表明吗啡长时作用于富含μ阿片受体的SH-SY5Y细胞也可产生类似于吗啡作用于整体动物所产生的依赖、戒断时cAMP水平的变化。本研究首次报道在吗啡长时作用的SH-SY5Y细胞中cAMP调节的PKA活性的变化，发现胞质可溶相PKA活性与cAMP水平的变化相似，在吗啡长时作用过程中也呈双相变化。即吗啡短时作用下胞质可溶相PKA活性受到抑制，吗啡长时作用下PKA活性明显升高；而膜相PKA活性未见明显变化。表明在吗啡长时作用的SH-SY5Y细胞中，cAMP水平的变化可能主要是调节可溶相而非膜相PKA活性。以上结果提示，阿片长时作用不仅可引起AC活性及cAMP水平的上调，还可导致AC/cAMP系统的其他环节如PKA活性的上调；从而进一步证实AC/cAMP系统的上调与“超高”代表了一种与阿片依赖和戒断有关的变化。AC/cAMP-PKA系统的增强可能与维持或上调以及使神经元处于过度激活状态有关，因此可能是形成和维持吗啡耐受依赖状态的一个重要机制。

蛋白质的可逆磷酸化是细胞信息传递的公共通路，是使细