中华结核和呼吸杂志2000年第23卷第4期

吴雪琼

关键词：结核病疫苗

1990年Wolff等^［1］报道他们在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨骼肌细胞中表达蛋白，至少2个月。经与美国Merck公司联合研究，1993年Ulmer等^［2］首先报道用甲型流感病毒基因免疫小鼠，不仅可表达蛋白，刺激机体产生特异性免疫应答，还可保护小鼠抵抗异株流感病毒的攻击。从此，核酸疫苗(nucleic acid vaccine)成为世界瞩目的防治传染病的研究新热点。

核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和载体组成，其直接导入机体细胞后，并不与宿主染色体整合，而是通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗(genetic vaccine)、基因免疫 (genetic immunization) 或核酸免疫 (nucleic acid immunization)，但目前研究最多的是DNA疫苗，由于其不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗(naked DNA vaccine)。这是近年来自基因治疗研究中所衍生而发展的一项新技术、新领域，1995年4月美国纽约科学院称核酸疫苗是疫苗学的新纪元。1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一。本文中概述了结核病DNA疫苗的研究进展。

初期国外主要有两个研究室从事结核病DNA疫苗的研究，一个是英国国立医学研究所，一个是美国Merck研究室，他们都取得了可喜的进展。1994年英国的Lowrie等^［3］和Silva等^［4-6］首先报道以麻风分支杆菌65 kD热休克蛋白（hsp65）基因的质粒DNA肌肉注射免疫小鼠，然后用结核分支杆菌或BCG攻击，结果细胞免疫功能显著增强，肝脏菌落形成单位（CFU）显著减少，表明DNA疫苗与常规BCG疫苗一样有保护作用。1997年Lowrie等^［7,8］、Bonato等^［9］进一步研究发现结核分支杆菌、麻风分支杆菌65 kD质粒DNA肌肉注射BALB/c小鼠后，用结核分支杆菌H₃₇Rv攻击，小鼠脾CD⁺₄CD^₈和CD⁺₈CD^-₄两种表型的hsp65反应性T细胞都显著增加，可检测出特异性抗体和(干扰素（IFN-γ），但未检测出白细胞介素4（IL-4）；通过逆转录PCR（RT-PCR）扩增鼠淋巴结中的细胞因子mRNA，证实IFN-γ和IL-12 mRNA增多，而IL-4、IL-10和IL-13 mRNA扩增阴性，表明Th1/Tc1型特异性细胞毒性反应占优势。此外，hsp65 dNA免疫的小鼠脾CD⁺₈CD^₄、CD⁺₄CD^-₈或γδ-TCR表型的hsp65特异性T细胞克隆都可将其免疫保护性转移给首次用来作实验的鼠，但CD⁺₈细胞克隆的效果最好。

1996年美国的Huygen等^［10］首次报道用结核分支杆菌Ag85编码基因的质粒DNA免疫鼠，可诱导小鼠产生很强的细胞和体液免疫反应，抵御活结核分支杆菌和BCG的攻击。Ag85复合物是结核分支杆菌和BCG主要的分泌性蛋白，可从早期培养液中分离，是一种热不稳定的蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和等电聚焦分析可分为三个组分Ag85A、Ag85B和Ag85C，分别为31 kD、30 kD和31.5 kD的蛋白质，Ag85A比Ag85B分泌的较多，而Ag85B在细菌表面分布的较多^［11］。1997年Ulmer等^［12］以结核分支杆菌Ag85复合物编码基因的质粒DNA免疫小鼠，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹分析，结果从Ag85复合物质粒DNA免疫小鼠的血清中可检测出高滴度的抗体反应，BALB/c鼠抗Ag85复合物抗体以IgG2a和IgG1为主，而C57BL/6小鼠以IgG2b占优势。Lozes等^［13］和Montgomery等^［14］分别用结核分支杆菌Ag85A、Ag85B和Ag85C编码基因的质粒DNA100 μg肌肉注射6～8周龄的雌性BALB/c和C57BL/6小鼠3次，每次间隔3周，第三次DNA注射后3周将鼠杀死。结果用Ag85A质粒DNA免疫的BALB/c和C57BL/6小鼠的脾细胞培养上清中，IL-2、IFN-γ和α肿瘤坏死因子（TNF-γ）水平比BCG免疫鼠显著增高；IL-6含量很低，未检测出IL-4和IL-10;该鼠产生显著的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性；血清中也检测出抗Ag85A抗体；但保护C57BL/6小鼠抑制BCG在肺部繁殖的能力比BCG免疫差。用Ag85B质粒DNA免疫的C57BL/6小鼠也产生同样的免疫效果，但BALB/c鼠却无效。用Ag85C质粒DNA免疫的这两种鼠均没有产生这些效果，说明该质粒DNA是无效的。1998年Denis等^［15］进一步研究了Ag85A质粒DNA免疫的BALB/c小鼠和结核分支杆菌免疫小鼠的抗原特异性免疫CD⁺₄-和CD^-₈-T细胞反应，证实Ag85A dNA免疫可产生更强、更广泛的T细胞反应和CTL活性。Ag85 DNA免疫鼠纯化的T细胞或T细胞克隆可将其保护性转移给首次作实验的鼠。

1999年Tanghe等^［16］报道以结核分支杆菌磷酸盐特异转运系统(phosphate-specific transport system, Pst S) 编码基因的三个质粒DNA Pst s-1、Pst S-2和Pst S-3免疫雌性C57BL/6鼠，结果每个质粒DNA均产生高水平的抗原特异性抗体和Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ，但结核分支杆菌H37Rv攻击后，只有Pst s-3 DNA免疫鼠的脾和肺细菌CFU数显著减少；Pst S-2 DNA免疫鼠只有脾的CFU中等减少；而Pst s-1 DNA免疫鼠却完全不能抑制细菌增殖。因此，Pst S-3也是一种理想的DNA疫苗候选者。

1998年Erb等^［17］研究发现用结核分支杆菌19 kD或Ahp c蛋白编码基因的质粒DNA免疫鼠，虽然可从血清中检测出抗19 kD或Ahp C抗体，通过蛋白多肽的MHC I类结合试验也可检测出存在CD^＋₈-T细胞决定簇，但却无抗这些多肽的CD^＋₈-T细胞反应，而且DNA免疫鼠和未免疫鼠在抑制细菌增殖方面无区别。由此可见，19 kD和Ahp C基因不能作为抗结核分支杆菌的DNA疫苗。

1997年Lowrie等^［7］的研究表明6 kD早期分泌蛋白抗原（6 kD early secretory antigenic target, 简称ESAT-6）的质粒DNA免疫小鼠可产生保护性，也可作为结核病DNA疫苗的候选者。而36 kD和hsp10 DNA免疫小鼠不能产生保护性，因而不能作为DNA疫苗。

由此可见，从结核分支杆菌分泌性蛋白和紧张性蛋白中发现的多种保护性抗原，如Ag85A、Ag85B、ESAT-6、hsp65、hsp70和Pst s-3等，其编码基因的质粒DNA免疫小鼠都可诱导产生强的细胞和体液免疫反应，抵御活菌的攻击，从而说明DNA疫苗无需靶向种特异性抗原，但必须针对细菌在增殖期和休眠期产生的抗原，编码一个或几个蛋白质抗原的DNA是能够产生与BCG同样效果的持续性保护作用^［18,19］。今后还需继续研究新的结核分支杆菌保护性抗原及其DNA免疫的保护性，以便筛选出更多较理想的DNA疫苗候选制品，研制更有效的结核病DNA联合疫苗。此外，DNA免疫在不同动物中效果不同，不同的质粒载体、免疫途径、处理方法对DNA免疫的效果也有极大影响，而目前结核病DNA疫苗都是在小鼠上进行的探索性研究，还需在较大的动物尤其是人身上证实其保护力，才能真正达到替代BCG或弥补其不足的目的。

作者单位：吴雪琼(100091北京解放军第三○九医院结核病研究室)

参考文献

1，Wolff JA, Malone RW, Williams P, et al. direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science, 1990, 247:1465-1468.

2，Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993,259:1745-1749.

3，Lowrie DB, Tascon RE, Colston MJ, et al. Towards a DNA vaccine against tuberculosis. Vaccine, 1994, 12:1537-1540.

4，Silva CL, Lowrie DB. A single mycobacterial protein (hsp65) expressed by a transgenic antigen-presenting cell vaccinates mice against tuberculosis. immunology, 1994, 82:244-248.

5，Silva CL, Silva MF, Pietro RCLR, et al. Protection against tuberculosis by passive transfer with T-cell clones recognizing mycobacterial heat-shock protein 65. Immunology, 1994, 83:341-346.

6，Silva CL, Pietro RCLR, Januario A, et al. Protection against tuberculosis by bone marrow cells expressing mycobacterial hsp65. Immunology, 1995,86:519-524.

7，Lowrie DB, Silva CL, Colston MJ, et al. Protection against tuberculosis by a plasmid DNA vaccine. Vaccine, 1997, 15:834-838.

8，Lowrie DB, Silva CL, Colston MJ, et al. Genetic vaccination against tuberculosis. Springer Semin Immunopathol, 1997, 19:161-173.

9，Bonato VL, Lima VM, Tascon RE, et al. Identification and characterization of protective T cells in hsp65 DNA-vaccined and M. tuberculosis-infected mice. infect Immun, 1998, 66:169-175.

10，Huygen K, Content J, Denis O, et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine.<