第四军医大学学报1999年第20卷第9期

江文黄远桂高华肖华胜

摘要目的：探讨红藻氨酸（KA）诱导大鼠癫痫发作时海马mGluR1 mRNA表达变化的时空特征.方法：采用地高辛标记的cDNA探针原位杂交法检测海马mGluR1 mRNA表达，通过图像分析系统进行定量处理.同时观察大鼠行为学及脑电变化.结果：KA注射后大鼠均出现严重边缘性惊厥，脑电图表现为持续性癫痫样放电.海马mGluR1 mRNA表达在注射KA后1h开始增高，4h～8h达高峰，之后逐渐回落，72h降至最低.结论:在癫痫发作早期，mGluR1表达增强，提示其可能参与癫痫发作，并可能与发作后脑损害有关.

关键词：癫痫受体,谷氨酸代谢型海马红藻氨酸脑电图

0引言

代谢型谷氨酸受体（mGluRs）的发现是谷氨酸能突触研究的一项重要进展.到目前为止，已经克隆出8种mGluRs亚型（mGluR1-8），依据序列的同源性、信号转导机制以及激动剂的选择性，可以将其分为3组，Ⅰ组包括mGluR1和mGluR5，Ⅱ组包括mGluR2和mGluR3，Ⅲ组包括mGluR4，6，7，8.Ⅰ组受体与磷脂酶C(PLC）偶联，激活后促使磷脂酰肌醇（PI）水解，产生三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG），IP3使内质网中Ca²⁺释放到胞浆中，导致胞浆中Ca²⁺浓度增高，DAG则可激活蛋白激酶C（PKC），增强NMDA受体介导的兴奋毒性^［1］.研究表明，Ⅰ组受体激动剂可以产生致痫作用，其拮抗剂可阻断多种实验性癫痫的发生^［2～4］，提示Ⅰ组受体在癫痫活动中发挥重要作用.由于既往多用药理学方法研究mGluRs的作用，而有关癫痫发作期间特定脑区mGluRsmRNA表达水平的动态观察研究较少，迄今国内尚未见报道.为此，我们采用红藻氨酸（kainicacid,KA）诱导大鼠癫痫发作模型，动态观察致痫前后Ⅰ组mGluR1亚型mRNA的表达变化，同时观察行为学和脑电图（EEG）表现，以期从分子水平进一步探讨癫痫的发生机制.

1材料和方法

1．1材料雄性SD大鼠34只，体质量200g～250g，随机分为对照组和注射KA后1,2,4,8,24,72h等7个实验组，每组4只，共28只.KA（Sigma公司）ip,10mg/kg，对照组生理盐水ip.6只大鼠用于描记EEG，所有大鼠均观察行为学变化.SD大鼠经戊巴比妥钠（ip,40mg/kg）麻醉后，固定在江湾Ⅱ型脑立体定位仪上，在双侧大脑皮质和海马放置电极导管，外径0.6mm，内置不锈钢电极，直径0.3mm，用牙托粉和502胶将导管固定在颅骨上.术后1wk用明思公司脑电记录仪(采用单极导联)分别描记正常清醒状态、以及注射KA或盐水后的EEG.

1．2方法各实验组于相应时间内用戊巴比妥钠麻醉，经升主动脉用100mL生理盐水快速冲洗，断头取脑，将脑组织包埋于干冰中10min～20min，再将速冻的脑组织移入恒冷箱切片机内平衡温度，选择海马部位进行切片，脑片厚15μm，裱贴在经APES（武汉博士德公司）处理的载玻片上，切片储存于-70℃备用.mGluR1cDNA重组质粒转化后扩增，碱裂解法提取质粒DNA，SacⅠ与EcoRⅠ双酶切下mGluR1cDNA片段，电泳鉴定后，按地高辛标记和检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司）进行随机引物法标记探针.杂交前取出脑片，风干.用40mL/L多聚甲醛0.1mol/LPBS固定10min，PBS浸洗，蛋白酶K1mg/L37℃孵育15min，0.1mol/L冷甘氨酸终止消化，2.5mL/L乙酸酐/0.1mol/L三乙醇胺封闭10min，PBS洗后依次进行700,900,1000mL/L乙醇脱水各2min，室温中晾干.切片加入预杂交液进行预杂交(42℃2h)，再加入杂交液42℃孵育18h，探针浓度为0.5mg/L.杂交后分别用2×SSC,1×SSC,0.5×SSC浸洗，再加入抗地高辛抗体室温孵育2h，NBT和BCIP显色液暗处显色4h，脱水，脱脂，封片.

原位杂交对照试验：①空白对照，部分切片不加标记的mGluR1cDNA探针进行杂交.②RNA酶消化对照，部分切片应用RNA酶预处理后再进行杂交.③阳性对照，用地高辛标记的β-actincDNA探针代替mGluR1cDNA探针进行杂交.

统计学处理：原位杂交结果认定结构部位后，经Leica真彩色图像分析系统进行灰度扫描、面积扫描.实验结果以均值±标准差（X±S_X）表示.采用SPLM统计软件进行多组均数的方差分析，NOSA软件作复式条图.

2结果

2．1大鼠行为表现KAip后，大鼠立即出现凝视，不动，至15min～30min后开始表现为“湿狗样运动”，40min～60min后出现自动症及轻度边缘性惊厥，70min～90min后出现严重边缘性惊厥状态，表现为流涎、姿势失衡、肢体阵挛等.持续至3h左右，症状开始减轻，之后抽搐呈阵发性发作.

2．2大鼠EEG变化注射KA后2min～5min，海马及皮质均出现癫痫样波发放，30min内癫痫样波呈阵发性出现，30min后呈持续性.其放电波形多样，以棘波、慢波、尖波、棘慢波为主（Fig1,2），并且不断相互转化.注射盐水后，未见癫痫样波发放.

图1正常大鼠脑电图

fig1Normal rat′s EEG

1.Cerebral cortex；2.Hippocampus.

图2注射KA后大鼠脑电图显示电发作活动

fig2EEG recordings showing electrical seizure activity after KA injection

1.Cerebral cortex；2.Hippocampus A.Spike discharges B.Spike and sharp wave discharges C.Slow wave and spike-wave and complexes discharges.

2．3海马mGluR1mRNA表达的时程变化正常大鼠海马结构中有丰富的mGluR1 mRNA表达，其中以齿状回颗粒细胞表达最多，与文献报道一致^［5］.注射KA后，齿状回、CA1，CA3，CA4区mGluR1 mRNA表达逐渐增高，于4h～8h达高峰，然后逐渐下调.经图像面积扫描分析：海马各区mGluR1 mRNA表达均于注射KA后1h增高，2h时增高有非常显著性差异（P＜0.01），CA1，CA3，CA4区表达在4h达高峰，齿状回区表达在8h达高峰（Fig3）.之后，表达逐渐回落，72h时达最低点，明显低于对照组（P＜0.05），如Fig4A所示.经图像灰度扫描分析：海马各区表达均于注射KA后开始增高，4h时增高有非常显著性差异（P＜0.01），之后，表达开始下降，至72h时明显低于对照组（P＜0.05），如Fig4B所示，空白对照及RNA酶消化对照结果均为阴性，β-actin对照结果为阳性.

图3注射KA后齿状回mGluR1mRNA的表达

fig3Expression of mGluR1 mRNA in the dentate gyrus after KA injection

A.Control×40；B.8h after KA injection×40；C.8h after KA injection×130.

图4注射KA后海马mGluR1mRNA表达变化的时间过程

fig4Time course of mGluR1 mRNA expression in the hippocampus after KA injection

a.Area scanning；B.Grey level scanning.

3讨论

KA诱导大鼠癫痫的发作表现、发作相关性脑损害以及发作的易感性都极其类似于人类颞叶癫痫，因此KA模型被广泛用于复杂部分性发作研究^［6］.本研究从大鼠行为学表现以及深部电极脑电图方面进一步证实了KA模型的可靠性.KA诱导大鼠癫痫发作的具体机制目前仍不十分清楚，但总的来说不外是脑内兴奋与抑制失平衡所致，谷氨酸作为脑内的一种兴奋性神经递质，在癫痫发作中扮演了重要角色^［7］.其作用的发挥主要通过两类受体来介导，一类是离子型受体，包括NMDA，AMPA和KA受体；另一类是代谢型受体，包括mGluR1-8.有关癫痫状态下离子型谷氨酸受体mRNA的表达变化既往已有报道^［8］.本研究着重观察了mGluR1 mRNA在癫痫发作后的时、空表达特征，结果表明，在癫痫状态下，海马各区包括齿状回、CA1，CA3，CA4区mGluR1 mRNA的表达先呈时间依赖性上调，继而表达逐渐下降.提示这些区域对癫痫活动较敏感，同时基因表达易受惊厥活动调控.

Akbar等^［9］在杏仁核点燃模型中研究发现：齿状回和CA3区mGluR1 mRNA在惊厥后24h表达最高，CA4区在第7日表达最高，CA1区在24h表达无变化.我们利用KA模型观察海马mGluR1 mRNA变化，结果与Akbar等有所不同，提示不同的致痫因素可能通过不同的途径调节相应受体的表达以及递质释放.mGluR1 mRNA在KA诱导大鼠癫痫发作早期（注射KA后4h内）表达急剧升高，促使PI水解加速，产生IP3和DAG，一方面导致细胞内Ca