中国媒介生物学及控制杂志2000年第11卷第1期

张吉斌陈国英明桂珍张绍清徐博钊

关键词：分子生物学按蚊近缘种种型鉴别

目前，全世界重要的媒介按蚊几乎都属于由几个甚至十几个近缘种组成的复合体，它们虽然形态相似，但其生态习性有明显不同，而且传疟作用也有显著差异。因此，单纯用形态分类方法已不能适应按蚊复合体近缘种和种内变异鉴别的需要。近年来，采用细胞遗传学分类方法、酶谱技术、化学分类法、特别是分子生物学技术，使按蚊复合体近缘种和种内变异的分类研究取得显著进展，同时对疟疾媒介判定和防制策略的制定起到重要的指导作用。

分子生物学应用于按蚊复合体近缘种和种内变异技术，主要包括聚合酶链式反应（PCR）和基因测序技术、DNA探针技术，随机引物扩增多态DNA（RAPD）技术、限制性酶切片断多态性（RFLP）技术。这些技术以生物大分子DNA为基础，从遗传本质上研究物种间的差别，结果敏感、特异和客观。本文从以上4个方面综述如下：

1PCR和基因测序技术

PCR技术是对特定的DNA片断通过解链-退火-延伸等步骤的多次循环，使之大量扩增，然后进行序列测定，比较其序列长度和碱基差异。国内外应用该技术对按蚊复合体近缘种的分类进行了大量研究。经科学家多年的探索发现，蚊虫体内多拷贝的核糖体DNA（rDNA），是一串联排列的中等重复的基因家族，由18S、5.8S、28S、RNA编码区、基因间间隔区(IGS)、第一和第二内转录间隔区(ITS1、ITS2)、外转录间隔区(EST)组成，其编码区和间隔区的进化速率不同，在亲缘关系密切的种间，编码区高度保守，而间隔区序列存在差异。由于趋同进化的影响，间隔区在种内高度保守，因此第二内转录间隔区(ITS2)的序列差异，特别适合于区分近缘种^〔1〕。如我国的徐建农等^〔2-3〕利用PCR技术，确定了海南省大劣按蚊属于大劣按蚊复合体(An.dirus complex)中的大劣按蚊A种；并且通过对大劣按蚊复合体的ITS2/rDNA序列测定，发现我国大劣按蚊有A、D两种。国外，以ITS2/rDNA为分类指标，采用PCR方法对按蚊复合体近缘种的分类报道较多，如Cornel等^〔4〕对四斑按蚊复合体(An.quadrimaculatus complex)成员种使用PCR和序列测定方法进行鉴别，可将5个难以区分的近缘种中的4个区分开，ITS2在种间的差异明显（18.5%～28.7%)；Porter和collins^〔5〕对佛氏按蚊(An.freeborni)、赫氏按蚊(An.hermsi)及落日按蚊(An.occidentalis)采用该方法鉴定，取得各蚊种的鉴别带，序列差异在4.9％～11.5％之间；Scott等^〔6〕对冈比亚按蚊复合体(An.gambiae complex)5个近缘种的IGS/rDNA进行PCR研究，获得明确的蚊种鉴定结果：Paskewitz等^〔7〕对冈比亚按蚊复合体5个近缘种的ITS2序列进行比较，发现它们的差异在0.4％～1.6％之间。利用PCR和基因测序技术灵敏度高，在规范操作条件下，能比较客观地根据特异扩增带和序列差异进行蚊种鉴定。

2DNA探针技术

不同物种有其特异的DNA片段。近10年来，国内外已将按蚊特异的DNA进行克隆、纯化，制成DNA探针，用于多个按蚊复合体近缘种的鉴别，如Collins等^〔8〕制备了冈比亚按蚊复合体6个近缘种的基因组探针，可鉴别其中5个近缘种。Hill等^〔9〕应用非放射性标记-碱性磷酸酶标记探针的方法制备了寡核苷酸探针，且制备较简单、便宜，杂交过程较简单，可在室温条件下完成全部实验操作。随后，Cooper等^〔10〕对刻点按蚊复合体(An.punctulatus complex)、Cockburn等^〔11〕对四斑按蚊复合体(An.quadrimaculatus complex)、Copeland等^〔12〕对巴拉巴按蚊复合体（An.balabacensis complex),用DNA探针对其近缘种进行分类研究。牛玲玲等^〔13〕用DNA探针鉴定我国疟疾的主要传播媒介中华按蚊和嗜人按蚊，此探针可用于不同发育期（幼虫、成虫）的蚊虫，取得较好结果。目前，DNA探针技术已发展成为比较系统、简便、快速、经济的方法，一次可分析大量蚊虫标本。通过不断改进，该技术不久可用于现场蚊虫快速鉴定。

3RFLP技术

生物种群在进化过程中，某些重复DNA序列既有量的变化，又有核苷酸序列的差异。那么用不同的限制性内切酶酶切后的DNA片断长度将不同。该方法不仅适用于种间分类，还可作为按蚊不同地理株种下分化的重要指标。李本文等^〔14〕对赫坎按蚊复合体（An.hyrcanus complex)的5个近缘种（中华按蚊、嗜人按蚊、凉山按蚊、克劳按蚊和小宽按蚊），采用3种不同的限制性内切酶对其基因组DNA进行酶切，结果5个近缘种酶切片断的带型有明显差异。李本文^〔15〕还对中华按蚊（An.sinensis)3地理株和嗜人按蚊（An.anthropophagus)两地理株，分别采用3种不同的限制性内切酶对其基因组DNA进行酶切，酶切片断的带型有差异，证实两种按蚊种下有分化现象。Beebe等^〔16〕用PCR-RFLP技术可区分刻点按蚊复合体（An.punctulatus complex)的近缘种。Romans 等^〔17〕用RFLP作为冈比亚按蚊复合体近缘种的遗传标记，并用于分类中。

4RAPD技术

RAPD是采用随机PCR引物扩增多态DNA片断，并从中找出可作为种间鉴定的序列。该方法可在分子生物学背景材料缺乏的情况下，利用极微量的DNA进行蚊种鉴定。Wilkerson等^〔18〕用RAPD方法成功地区分了冈比亚按蚊（An.gambiae)、阿拉伯按蚊（An.arabiensis）、白跗按蚊（An.albitarsis)和白跗按蚊复合体4个近缘种。但RAPD技术最适应于按蚊种内不同地理亚种的区分。该技术的主要缺点是PCR引物短（10～12个碱基对），在不同的实验室、设备和试剂条件下，或由于不同的DNA抽提和储存方法，常常难以重复^〔19〕。该方法有待进一步完善。

分子生物学用于按蚊分类的研究虽然方法比较多，利用比较广泛，但仍然有些问题尚待解决，如分子数据与形态数据哪个价值大，种间和种内ITS2/rDNA变异有部分重叠，种间和种内界限如何确定，有些方法费用偏高，结果不够稳定^〔20〕。我们相信，这些问题经过科学工作者的深入研究，将会逐步得到解决。

第一作者简介：男，1965年生，汉族，毕业于华中农业大学，理学硕士，副研究员，媒介室副主任作者单位：张吉斌（湖北省医学科学院寄生虫病研究所武汉430079）陈国英（湖北省医学科学院寄生虫病研究所武汉430079）明桂珍（湖北省医学科学院寄生虫病研究所武汉430079）张绍清（湖北省医学科学院寄生虫病研究所武汉430079）徐博钊（湖北省医学科学院寄生虫病研究所武汉430079）

参考文献

1，Kjer KM, baldridge AM, Fallon Am.Mosquito large subunit ribosomal RNA:simultaneouse alignment of primary and secondary structure. Biochimica et Biophysica acta,1994,1217∶147.

2，徐建农，瞿逢伊.用rDNA研究海南省大劣按蚊的种型分类地位.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1997,9∶269.

3，Xu jiannong and Qu fengyi. Ribosomal DNA difference between species A and D of the Anopheles dirus complex of mosquitoes from China. Med Vet entomol,1997,11∶134.

4，Cornel AJ,Porter CH,Collins FH.Polymerase chain reaction species diagnostic assay for Anopheles quadrimaculatus cryptic species(Diptera∶Culicidae)based on ribosomal DNA ITS2 seqences. J Med Entomol,1996,33∶109.

5，Porter CH and Collins FH. Species-diagnostic differences in a ribosomal DNA internal transcribed spacer from the sibling species Anopheles freeborni and anopheles hermsi(DIPtera∶Culicidae).Am J Trop Med Hyg,1991,45∶271.

6，Scott JA, Brogdon WG ,Collins FK. Identification of single specimens of the anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Hyg,1993,49∶520.

7，Paskwitz SM, Wesson DM, Collins FH. The internal transcribed spacers of ribosomal DNA in five members of the Anopheles gambiae species complex. Ins Mo1 bio,1993,2∶247.

8，Collins FH,Mendez MA, Rasmussen SO,et al.A ribosomal RNA gene probe differentiates member species of the Anopheles gambiae complex.Am J Trop Med hyg,1987,37∶37.

9，Hill SM,Urwin R, Crampton JM, A comparison of non-radioactive labelling and detection systems with synthetic oligonucleotide probes for the species identification mosquitoes in the Anopheles gambiae complex. Am J Trop Med hyg,1991,44∶609.

10，Cooper L,cooper RD, Brukot TR.The Anopheles punctulatus complex:DNA probes for identifying the Australian species using isotopic,chromogenic and chemiluminescence detection system.Exp parasitol,1991,73∶27.

11，Cockburn AF,Tarrant CA,Mitchell S. Use of DNA probe to distinguish sibling species of the Anoph