第四军医大学学报1999年第20卷第9期

苏映军陈璧贾赤宇徐修礼

摘要目的：观察地白忍煎剂(DBRD)对角朊细胞和成纤维细胞增殖的影响以及对成纤维细胞收缩功能的潜在作用.方法：将人角朊细胞和真皮成纤维细胞分别培养于含不同稀释度DBRD的培养基中，以噻唑蓝染色法测定细胞增殖率.采用体外胶原立体培养模型观察DBRD作用后成纤维细胞收缩功能的变化.结果：1∶10⁷稀释的DBRD对角朊细胞和成纤维细胞均具有促增殖作用，而1∶10稀释的DBRD仅促进角朊细胞的增殖.DBRD剂量依赖性地抑制含成纤维细胞的胶原凝胶块的收缩率，且该抑制作用可被仅含100mL/L胎牛血清的培养基逆转.结论：DBRD可促进角朊细胞和成纤维细胞的增殖,并可逆性地抑制胶原立体培养的成纤维细胞的收缩功能.

关键词：伤口愈合细胞，培养的角朊细胞成纤维细胞

0引言

许多中草药制剂对于浅度烧伤创面具有良好的治疗作用^［1,2］.地白忍煎剂(DBRD)由地榆、白芨、忍冬藤和虎杖配伍而成，用于临床治疗Ⅱ°烧伤创面.临床观察显示，DBRD使创面愈合加速、创面水肿及创面组织脱水程度减轻，这些疗效经小鼠热力烫伤模型组织学研究得以证实^［3］.然而，该中药煎剂对皮肤角朊细胞和成纤维细胞的作用机制不详.为此，我们通过体外实验研究其对上述两种细胞的增殖以及对成纤维细胞收缩功能的影响.

1材料和方法

1.1材料①地白忍煎剂:DBRD为室温保存的粘稠草药煎剂.实验当日分别以角朊细胞无血清基础培养基(KBM,Clonetics)和DMEM(Gibco)培养基配制成含不同稀释度的DBRD溶液，经0.2μm微孔滤膜过滤除菌待用.细胞增殖和胶原凝胶收缩实验中所用DBRD稀释度范围为1∶10～1∶10⁹.细菌内毒素对于多种类型的细胞的增殖、分化以及物质合成具有多种影响^［4,5］,DBRD在煎制过程中可能受到内毒素的污染.我们用鲎试剂盒（福州东方鲎试剂厂）检测了DBRD中细菌脂多糖(LPS)的含量，操作步骤按说明书进行，结果LPS阴性.②细胞培养：2代～3代人包皮角朊细胞以1×10⁴细胞/孔接种于24孔培养板，每孔加入1mL角朊细胞生长培养基(KGM)，其成分由KBM及添加物1×10^-7g/L人重组表皮生长因子(hrEGF)，5×10^-4g/L氢化考的松，5×10^-2g/L硫酸庆大霉素，5×10^-5g/L二性霉素B，3×10^-2g/L牛脑垂体浸出液和5×10^-3g/L胰岛素组成.细胞于37℃50mL/LCO₂培养箱内培养48h，以PBS洗3次，再以KBM培养24h后,每孔加入1mL含有DBRD的KBM，对照组仅加入KBM，隔日换液.第5，7日以MTT法^［6］检测细胞代谢状态.将第5代人真皮成纤维细胞以1×10³细胞/孔的密度接种于96孔板中，每孔加入含100mL/L胎牛血清(FCS),1×10⁵IU/L青霉素,100mg/L链霉素的DMEM100μL.培养48h后，弃去培养液，以PBS洗3遍，再分别加入含有不同稀释度DBRD的100μLDMEM(含5mL/LFCS)，DMEM(含5mL/LFCS)作为试验对照.不同时间点检测成纤维细胞的代谢水平.

1.2方法

1.2.1细胞增殖状态的检测采用噻唑蓝(MTT)呈色法^［6］进行测定.具体方法为将含有细胞的24孔培养板内各孔培养基中加入MTT溶液100μL(MTT终浓度为5mg/L)，37℃条件下培养2h后，弃培养液,加入1mL二甲基亚砜(DMSO)溶液，继续培养6h，轻轻振荡15min，各孔内溶液分别转至1mL比色杯中，采用ShimadzuUV-160光密度仪于570nm波长测A值.以MTT比色法测定96孔培养板内细胞的代谢状态时，同样先加入MTT溶液并培养2h后弃培养液，各孔加入100μLDMSO溶液，振荡15min后于570nm波长下用酶联免疫仪(DynatechMR-5000)测定A值.DMSO溶液作为光密度测定时的空白对照.

1.2.2胶原凝胶的制备培养至100%融合的人成纤维细胞经胰蛋白酶消化、离心收集，以DMEM(含10mL/LFCS)重悬细胞并计数，调整细胞密度为3.35×10⁸/L.按照2份NaHCO₃(11.76g/L)溶液、1份含20mmol/L谷氨酰胺的10×DMEM培养液和5份I型鼠尾胶原溶液(1.6g/L)的体积比在冰浴中配制胶原聚合液，以NaOH将pH值调至7.2，然后加入2mL细胞悬液.取2mL上述细胞胶原悬液加入到直径为35mm的Petri培养皿内，于37℃孵箱内放置10min形成凝胶，实验组培养皿内各加入1mL含有不同稀释度DBRD的DMEM(含10mL/LFCS)，对照组仅加入1mLDMEM(含10mL/LFCS)，凝胶的底部和侧面与培养皿粘连处以加样匙加以分离，之后继续于孵箱内培养并于不同时间点测量凝胶面积.

数据统计：采用Statview512^TM统计软件包进行单因素方差分析和Scheffe检验，显著性差异水平设为95%.

2结果

2.1DBRD对角朊细胞增殖的影响DBRD加入2d后（实验第5日），1:10⁵稀释度组的角朊细胞经MTT法检测的A值为对照组的142%并具有明显差异(P＜0.05)，余各组间无明显差异（Fig1）.实验第7日，1∶10和1∶10⁷DBRD稀释度组A值分别为对照组的206%和156%，差异显著(P＜0.05).其余各组与对照组相比无明显差异.

图1DBRD对人包皮角朊细胞增殖的影响

fig1Effects of DBRD on human foreskin keratinocyte proliferation

2.2DBRD对成纤维细胞增殖的影响第4日时间点，1∶10⁷和1∶10⁹稀释度DBRD使真皮成纤维细胞的增殖分别明显增加至对照组细胞的157%和160%(P＜0.05,Fig2），至第7日时，成纤维细胞的增殖仍明显高于对照组(P＜0.05)，其余各组间无明显差异.值得注意的是1∶10³稀释度DBRD使成纤维细胞第4日和第7日时的代谢状态分别降低至对照组的42%和29%，但无统计学差别.

图2DBRD对人真皮成纤维细胞生长的作用

fig2Effects of DBRD on human dermal fibroblast growth

2.3DBRD对胶原凝胶收缩的影响本实验模型中，各组胶原凝胶最大收缩率均发生在实验开始后的4，5d之内，至第7日到10日时，胶原凝胶面积的改变趋于稳定（Fig3）.在对照组中，成纤维细胞收缩使第12日时胶原凝胶的面积减小到初始面积的12.18%，为各组胶原凝胶收缩程度之最.1∶10至1∶800稀释度的DBRD可呈剂量依赖性的抑制成纤维细胞对胶原凝胶的收缩.第12日时，1∶100,1∶200和1∶800稀释度的DBRD使凝胶分别收缩至初始面积的77.6%,32.2%和16.9%，且分别较对照组的收缩程度减少了65.4%,20.0%和4.8%，但在此时间点，仅1∶100和1∶200DBRD稀释度组与对照组间有统计学差异.在整个实验期间，经1∶10稀释度的DBRD作用后，未见胶原凝胶的收缩，而1∶10³及更大稀释度的DBRD使胶原凝胶的收缩程度与对照组基本一致.我们还观察到，DBRD抑制人真皮成纤维细胞的收缩作用为可逆性的.胶原凝胶在含有1∶100,1∶200和1∶800稀释度DBRD的DMEM中培养5d后，将培养基更换为DMEM/100mL/LFCS可恢复凝胶的进一步的收缩，使第12日时的胶原面积较含相应稀释度DBRD作用后的凝胶面积分别减小了35.2%(P＜0.01),13.8%(P＜0.05)和3.6%.于第5日培养基更换为DMEM(含10mL/LFCS)后，1∶800及更高稀释度DBRD组内的胶原面积未见明显改变.对于1∶10DBRD稀释度组，第5,3甚至第1日时,将培养基更换为DMEM(含10mL/LFCS)后均未见胶原凝胶的收缩.

图3DBRD对胶原凝胶内成纤维细胞收缩功能的影响

fig3Effects of DBRD on fibroblast contraction in collagen lattice.Changes of

lattice consistently cultured in DBRD are indicated by solid symbols.Open

symbols illustrate the changes of the lattice after the removal of DBRD from

culture media since day 5

3讨论

DBRD于20世纪70年代由我科研治并用于临床治疗皮肤烧伤，该煎剂成分主要由地榆、白芨、忍冬藤和虎杖组成，临床观察以及在动物模型上进行的在体实验显示DBRD具有减轻创面水肿程度、减少渗出的作用^［3］.此外，DBRD还可在烧伤创面表面形成一层药痂,防止局部组织脱水，同时为创面细胞活力的恢复和创面再上皮化提供适宜的局部环境.但DBRD对创面愈合过程中起主要作用的两种细胞--角朊细胞和成纤维细胞的影响尚未见报道.因此，本实验通过细胞培养法观察了DBRD对上述两种细胞的生物学效应.

研究证实，培养细胞的生长在很大程度上受培养基内添加物的影响.常规培养细胞时所采用的无血清培养基内含表皮生长因子、氢化考地松和胰岛素，这些添加物可明显促进细胞增殖并改变细胞的代谢状态^［7］.此外，内毒素可调节成纤维细胞的增殖和角朊细胞的分化^［4,5］.<