福建医科大学学报2000年第34卷第1期

唐南洪殷凤峙王晓茜李秀金

摘要:目的探讨维持培养成人肝细胞较长时间高活性的方法。方法采用限制贴壁、培养液中加入细胞生长因子和激素、持续轻微旋转的方法培养肝细胞。定期进行活细胞计数及培养上清液中人白蛋白浓度检测，并在光镜和透射电镜下观察细胞生长情况。结果肝细胞有一定程度的增殖，从第2天至第14天活细胞密度可维持在4.0×10⁵/ml以上，分泌白蛋白可维持较高功能状态至20天左右，均明显优于对照方法；光镜观察旋转的细胞聚集体可基本保持形状至20天，电镜亦显示培养至15天的悬浮聚集体肝细胞仍具有正常肝细胞超微结构特征。结论应用该法能较长时间保持成人肝细胞的高活性状态，可用于生物人工肝系统所需的细胞供体培养。

关键词:肝,细胞学细胞培养

目前，国内外肝细胞移植和生物人工肝的研究日趋深入，其中的关键环节是在游离活肝细胞后，如何保持较长时间的活力和功能^［1］。普通单层培养肝细胞贴壁生长后，再次消化易致肝细胞损伤和活力显著下降，实际应用意义不大^［2］。1998年8月～1999年7月，作者综合应用限制贴壁及激素限定持续旋转培养等技术进行正常成人肝细胞培养，报告如下。

1材料与方法

1.1正常肝细胞的获取在肝血管瘤患者切除的部分肝叶上取距血管瘤5 cm以上、正常肝部分约1.5 cm×2 cm×4 cm肝组织。少许组织用于病理检查。其余置4℃ F12培养液中，立即移入实验室，参照Strom方法^［3］灌注，肝组织剪碎，离心后将细小肝组织块置入含0.05％胶原酶Ⅳ和0.01％透明质酸酶的DF 液中(DMEM∶F12 Ham=3∶1)，37℃轻轻搅拌30 min后，在200目不锈钢网上稍加研磨并滤过肝细胞，离心50 g×3 min，DF液洗3次，调整细胞浓度为4.0×10⁵/ml。

1.2肝细胞的培养将12％Poly-HEMA乙醇溶液按0.1 ml/cm²被覆3 cm×5 cm玻璃培养瓶，置净化台自然吹干后，PBS洗3次备用；分离的肝细胞经锥虫蓝染色，活力达90％以上，接种于培养瓶内，加入磁力转子，置37℃ 5％CO₂,湿度为100％条件下培养，每15～30 min旋转一次，4 h后更换DFH培养液(DFH为含胎牛血清、胰岛素、胰高血糖素、地塞米松、上皮细胞生长因子及肝生素等物质的DF液)，继续每4 h旋转一次，2 min/次，至24 h更换培养液；保持转子以30～40 r/min，每24 h时更换培养液(以上简称Ⅰ法)；另设对照组为Poly-HEMA限制贴壁加激素静置培养(简称Ⅱ法)和Poly-HEMA限制贴壁不加激素旋转培养(简称Ⅲ法)。

1.3培养肝细胞的功能和形态观察

1.3.1活肝细胞数量测定定期取培养肝细胞，离心轻轻打散后经0.4％锥虫蓝染色并计数，计数3次取平均值。

1.3.2肝细胞合成人白蛋白功能的检测定期收集培养肝细胞上清液，离心去除游离细胞及细胞碎片，上清液置-70℃保存。采用薛国柱等^［4］报道的方法，在放免仪上进行人白蛋白浓度检测，计算合成的白蛋白量。每一份标本作三复孔，取平均值。人微量白蛋白检测试剂盒为北方生物技术研究所产品。

1.3.3光镜及透射电镜观察采用倒置相差生物显微镜（日本Olympus PM-10AD型）和自动显微摄影装置（XSZ-D2型，重庆光学仪器厂）对培养的肝细胞进行定期观察；并分别取培养5， 10， 15， 20天的肝细胞，常规方法制样，透射电镜观察拍照。

1.4统计学处理结果以X±S表示，显著性检验采用t检验。

2结果

2.1Poly-HEMA限制贴壁加激素旋转培养与两种对照培养法肝细胞的生长曲线比较见图1。Ⅰ法培养的肝细胞有一定程度的增殖，第2天至第14天活细胞数量可维持在4.0×10⁵/ml以上，于第8天时达最高值5.1×10⁵/ml，均明显高于对照方法。

图1三种培养方法肝细胞生长曲线

●:限制贴壁+激素+旋转(Ⅰ)■:限制贴壁+激素(Ⅱ)▲:限制贴壁+旋转(Ⅲ).Ⅰ法与Ⅱ法比较,**:P＜0.05，*:P＜0.01(n=4)； Ⅰ法与Ⅲ法比较,++:P=0.05，+:P＜0.01(n=4).(图2同).

2.2Poly-HEMA限制贴壁加激素旋转培养与两种培养法肝细胞的白蛋白合成曲线比较见图2。Ⅰ法培养的肝细胞合成白蛋白浓度曲线基本同生长曲线，于第8天时达最高值(6.3 μg/ml)，维持较高分泌白蛋白功能可至20天左右，均明显优于对照方法。

2三种培养方法肝细胞合成白蛋白曲线

2.3持续旋转培养肝细胞的光镜观察肝细胞经旋转4 h后，细胞有明显的粘连倾向，可见少则5～7个细胞，多则30～50个呈簇状相连，悬浮于培养液中，继续旋转培养24 h后，粘连聚集的细胞进一步增多，可达80％～90％，呈大小形态不一的聚集体，细胞界线不清，此后持续轻微搅动培养，旋转的细胞聚集体可基本保持形状至20天，以后聚集体有分散的趋势，22～24天仅见少量聚集体，其余为单个死亡细胞或死亡细胞粘连团(图3,4)。

3 旋转培养24h，肝细胞已开始形成大小不一的聚集体(相差显微镜 ×200)

4 持续旋转培养10天， 肝细胞聚集体生长状态良好，可见以核细胞(相差显微镜 ×200)

2.4持续旋转培养肝细胞的透射电镜观察培养5,10,15 天的悬浮聚集体肝细胞大多具有正常肝细胞超微结构特征，仅少量肝细胞胞浆内出现轻度线粒体水肿和内质网扩张等可逆性改变，培养20天的悬浮聚集体部分具有正常超微结构和线粒体轻度水肿，还可见线粒体嵴消失、溶酶体增多和细胞膜破裂等改变，表明培养至20天以后死亡细胞开始增多(图5,6)。

5持续旋转培养15天，肝细胞仍保持良好的超微结构特征(透射电镜×6000)

图6持续旋转培养20天，肝细胞开始死亡，可见线粒体嵴消失、溶酶体增多和细胞膜破裂等改变(透射电镜×2400)

3讨论

正常生理状态下，成人肝细胞处于静止期，只有在损伤等病理状态下，才能发生有限再生，其再生的机理很复杂，体外培养很难使肝细胞连续传代增殖。通过大量研究表明，人正常肝细胞表面存在某些生长因子受体和激素受体，在培养液中加入合适的外源性生长因子和激素，共同发挥生物效应，对促进体外培养肝细胞的生长、分化、增殖及生物学功能的维持具有重要作用^［5］。如上皮生长因子(EGF)可维持肝细胞中高水平的DNA含量^［1］，而在培养液中加入胰岛素，在8～24 h内即出现DNA和嘌呤的合成增加，胰高血糖素、胰岛素、地塞米松可维持高水平的糖原及尿素合成功能，从而增强肝细胞的代谢能力和适应能力等^［6］。笔者的实验应用DF培养液加入不同浓度的EGF、胰高血糖素、胰岛素、地塞米松和肝生素等，在Poly-HEMA限制贴壁和旋转培养条件下，肝细胞有一定程度的增殖并能维持较高水平的活力和合成白蛋白的生物学功能达20天，而未加这些生长因子和激素的限制贴壁旋转培养的肝细胞则不能增殖，迅速死亡。

除Poly-HEMA被覆法外，近年来相继有用无血清激素限定法、 阳性电荷法、旋转法进行各种肝细胞培养的报道^［7］，应用结合限制贴壁加激素与持续旋转培养聚集肝细胞法培养的肝细胞在维持活细胞数量和合成白蛋白功能的时间上明显长于限制贴壁加激素静置培养法，表明肝细胞经旋转搅动培养24 h后，80％～90％的肝细胞形成多细胞聚集体悬浮游动，持续轻轻搅动维持其形态，细胞间相互调节作用更类似于体内的三维环境，短期内有利于维持其活性和发挥生物学功能。笔者认为，结合Poly-HEMA限制加激素与持续旋转培养的聚集肝细胞,可以克服普通单层贴壁培养因再次消化而致肝细胞的损伤和取用不方便的缺点，为生物人工肝系统所需的具有高分化特异性生物功能的细胞供体培养和应用作出有意义的探讨。

基金项目:福建省科委科研基金资助项目(97-Z-57)

作者简介:唐南洪,男，1967年6月生，主管检验师.

作者单位：唐南洪(福建医科大学 附属协和医院,福建省肝胆外科<