中国微生态学杂志2000年第12卷第2期

黄毅肖晓蓉朱硃

摘要采用碱解法从11株产黑色素类厌氧杆菌(Black-Pigmented Anarobic Bod， 简称BPAB)中提取其质粒DNA，其中有5株有质粒DNA，其分子量大小不等，有的有超螺旋、开环、闭环三种结构，有的只有开环一种结构，对这几株细菌质粒DNA的深入研究，可为今后将该质粒作为载体用于基因工程奠定基础。

关键词：产黑色素类厌氧杆菌质粒

产黑色素类厌氧杆菌(Black-Pigmented Anarobic Bod， 简称BPAB)是一组从口腔分离的，产黑色素的革兰阴性厌氧杆菌，其中的牙龈卟啉单胞菌被认为是牙周炎的特异致病菌^［1，2］。质粒作为细菌染色体外辅助性遗传物质，可以编码特殊功能的蛋白质，赋予不同表型，包括对抗生素的抗性，产生细菌素、酶等。质粒也被作为载体应用于基因重组。本文拟采用碱裂解法小量、快速提取BPAB质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳法分离并确定质粒分子量大小，为构建其物理图谱，分析其限制性内切酶酶切位点关系，为探讨该质粒作为载体用于基因重组的可能性打下基础。

1材料与方法

1.1菌种

1.1.1菌株BPAB菌株共11株，包括牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC33277，牙龈卟啉菌W-83，栖牙普氏菌(Prevotella densicola),产黑色素普氏菌(Prevotella melaninogenicus),中间普氏菌(Prevotella intermedicus),躯体普氏菌(Prevotella corips),不解糖卟啉菌(Porphyromonas asacharolytica),黑色普氏菌(Prevotella nigrescens)及临床株39-4-1和39-4-4。阳性对照株大肠杆菌，阴性对照株血链球菌H₇-4。

1.1.2培养基及生长条件培养基为牛心脑辅助(BHI-S)厌氧菌分离培养基，倾注平皿时，补充Hemin-Uitk和5%脱纤维兔血，厌氧条件(80%N₂,10%H₂，10%(O₂)孵育48h，PBS液收集生长在平皿上的细菌。

1.1.3试剂溶液Ⅰ 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris-Hcl， pH8.0， 10mmol/L EDTA; 溶液Ⅱ(新鲜配制)： 0.2mol/L NaOH， 1% SDS; 溶液Ⅲ： 100ml、 60ml、 5mol/L 醋酸钾， 11.5ml 冰醋酸， 28.5ml水；TE： pH8.0 10mmol/L Tris-HCl， pH8.0 1mmol/LEDTA pH8.0； STE 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 10mmol/L NaCl， 1mmol/L EDTA; 饱和酚， 氯仿溶液。

1.2方法PBS液收集BHI平皿上细菌，5 000rpm离心5min，弃上清，STE溶液洗涤2次，沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，强烈振荡混匀；加入200μl溶液Ⅱ，颠倒5次，温和混匀，冰浴3min；加入150μl溶液Ⅲ，混匀，冰浴5min。12 000rpm离心10min，弃沉淀，上清液中加入等体积饱和酚，混匀，12 000rpm离心5min，吸取上层水相，用等体积酚—氯仿抽提，吸取上层水相，氯仿抽提，吸取上层水相，加入1/10体积溶液Ⅲ和2倍体积无水乙醇，室温放置5min，12 000rpm离心10min，沉淀用70%乙醇洗涤1次，溶于20μl TE溶液，DNA溶液加等体积上样缓冲液，跑电泳，电压90V，电流50mA，电泳约4h。

2结果

产黑色素类类杆菌质粒DNA凝胶电泳结果。从图1可见，产黑色素普氏菌有三条区带，其迁移距离在23.136bp和9.416bp的λHindⅢDNA片段之间，牙龈紫质单胞菌33277有一条质粒DNA区带，其迁移距离与9.416bp的λHindⅢDNA片段相同，故其分子量为9.416bp。从图2可见，阳性对照株大肠杆菌有一条质粒区带，分子量也为9.416bp，不解糖卟啉单胞菌在凝胶中部有一条质粒区带，远端为RNA。从图3可见，躯体普氏菌有一条质粒DNA区带，其迁移距离与分子量为23.130bp的λ HindⅢDNA片段相同，故其分子量为23.130bp。从图4可见，不解糖卟啉单胞菌在距样品槽1cm处有一条质粒DNA区带，但较淡。其它菌株未见质粒DNA区带，样品槽内荧光物质为提取过程中未去净的染色体DNA。

图1λHindⅢ：λDNA HindⅢ片段

P_m产黑色素普氏菌，P_g牙龈卟啉菌33277，

p_a不解糖卟啉菌，H₇-4血链菌H₇-4。

图2λ HindⅢ：λDNA HindⅢ片段

大肠大肠杆菌，P_g牙龈卟啉菌，

p_a不解糖卟啉菌，P_m产黑色素普氏菌。

图3λHindⅢ：λDNA HindⅢ片段

P_c躯体普氏菌，P_d栖牙普氏菌，

p_n产黑色普氏菌，P_gw-83牙龈卟啉菌w-83。

图4λ HindⅢ：λDNA HindⅢ片段

P_gw-83牙龈卟啉菌w-83，P_d栖牙普氏菌，P_i不解糖卟啉菌，P_gATCC 33277 牙龈卟啉菌33277，39-4-1产黑色素类杆菌临床分离株，39-4-4产黑色素类杆菌临床分离株。

3讨论

早在1940年，就有学者开始对质粒进行研究，已在各种细菌中发现质粒；1973年，Danny从变形链球菌LM—7菌株中分离出一种小质粒，以后又从伴放线杆菌，口腔螺旋体，中间型类杆菌等中分离出质粒DNA，并对其特征进行研究，1989年，Olsivk B等对进展性牙周炎患者病损部位分离出的伴放线杆菌质粒进行研究，发现这些菌株中除含有与标准株相同的20MDa大质粒外，还有标准株所没有的小质粒^［3］。1995年，Caudry S等提取15株标准株口腔螺旋体和9株临床分离株的质粒，也发现同种不同株螺旋体质粒分布情况不相同^［4，5］。但迄今为止，还未见国内外有关于口腔产黑色素类类杆菌质粒分布情况的报道。本研究所提取的产黑色素类类杆菌菌株质粒DNA中，最标准的为产黑色素普氏菌的质粒DNA，含三条区带，包括开环、闭环和超螺旋结构，而其它菌株的质粒DNA只含一条区带，可能为提取过程中，超螺旋被打断，只含开环一种结构。本实验采用的碱裂解法提取质粒是首次将提取大肠杆菌的质粒用于口腔细菌质粒DNA的提取，结果稳定；琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色DNA的方法可检测的最小量DNA约为2ng，十分敏感，因此本实验所得质粒DNA情况是可靠的。本研究所提取的11株产黑色素类类杆菌中，只有产黑色素普氏菌、牙龈卟啉菌33277、不解糖卟啉菌、躯体普氏菌有质粒DNA，并且其分子量大小不一，临床分离株未见质粒DNA，说明质粒有种的特异性，但不能作为区分标准株和临床分离株的指标。在自然条件下，很多质粒都可以通过细菌接合转移到新宿主内，对这几株质粒DNA的深入研究包括构建其物理图谱，可为今后将该质粒作为载体或将产黑色素类类杆菌作为宿主用于基因工程奠定基础。

作者简介：黄毅(1966-)，男，助理研究员，硕士学位研究生，主攻方向为口腔分子生物学。

作者单位：黄毅（华西医科大学口腔医学院 口腔生物医学工程重点实验室，四川 成都610041)

肖晓蓉（华西医科大学口腔医学院 口腔生物医学工程重点实验室，四川 成都610041)

朱硃（华西医科大学口腔医学院 口腔生物医学工程重点实验室，四川 成都610041）

参考文献

［1］SLOTS J. The predominant cultivable microflora of advanced periodontitis［J］. Scand J Dent Res, 1977,85:114-121.

［2］SPIEGEL CA, HAYCLUK SE, et al. Black-pigmented Bacteroides from clinically characterized periodontal sites［J］. J Periodent Res, 1979, 14:376-382.

［3］SMITH,DJ ANDERSON JM, et al. Oral streptococcal colonization of infants［J］. Oral Microbiol Immunol, 1993,8(1):1-4.

［4］DEMUTH DR, GOLUB EE, et al. Streptococcal-Host Interactions. Structural and functional analysis of a streptococcus sanguis receptor for a human salivary glycoprotein［J］. J Biol Chem, 1990, 265(13):7120-7126.

［5］TAMURA M,HARA T, et al. Adsorption of salivary proteins to the surface of oral streptococcal cells［J］. J Nihon clniv sch Dent, 1994,36(4):276-282.