中华实验外科杂志2000年第17卷第3期

詹勇强吴在德

摘要目的探讨pDR2/TK基因经大鼠肝左叶动脉注射后的靶向性表达及杀伤效应。方法将48只大鼠随机分为4组，分别给予pDR2/TK基因、更昔洛韦(ganciclovir,GCV)、pDR2/TK基因/生理盐水(NS)、缓冲液(TE)/GCV及TE/GCV。肝组织用原位杂交、免疫组织化学ABC法及苏木素-伊红(HE)染色的方法检测基因转录、表达及杀伤效应。结果pDR2/TK基因在肝左叶有转录。单独注射pDR2/TK基因组的肝左叶的表达率为(4.86±2.13)%，明显高于肝右叶［(2.04±0.91)%，(P＜0.01)］，未见明显的肝细胞坏死；注射pDR2/TK基因+GCV组的肝左叶表达率为(4.34±1.43)%，亦高于肝右叶［(2.31±0.78)%，(P＜0.01)］，肝左叶出现明显的大片状坏死，肝右叶坏死程度轻微；2组间的肝左叶或肝右叶表达率差异无显著性(P＞0.05)。结论pDR2/TK基因经一侧肝叶动脉注射后联用GCV可在该肝叶内有靶向性的表达及杀伤效应。

关键词：TK基因基因治疗EB病毒

我们将携带单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的pDR2/TK质粒经大鼠肝左叶动脉直接注入肝内，联合应用更昔洛韦(ganciclovir, gCV)腹腔注射，通过对组织进行原位杂交、免疫组织化学及常规HE染色，观察pDR2/TK基因在左右肝叶内的表达及其杀伤效应。材料和方法

1.质粒提取、探针制备及其他生化试剂：pDR2/TK质粒由胡俊波博士在北京微生物所构建并惠赠，其载体pDR2含有EB病毒复制所必须的序列组件(oriP及ENNA-1)，TK基因来源于pHSV106。更昔洛韦购自湖北省医药工业研究所。各种限制性内切酶购于Promega公司。回收用低溶点琼脂糖购自Gibcobrl公司。用于mRNA原位杂交的DNA探针为pDR2/TK质粒经限制性内切酶PST i及EcoR V双酶切取，选用TK基因5′端第214～642 bp之间的428 bp DNA片断。原位杂交的探针标记及检测试剂盒购自Boehringer公司，免疫组织化学ABC试剂盒购自北京华美生物工程公司。

2.动物实验：雄性SD大鼠48只，220～250 g，随机分为4组。乙醚麻醉后，手术结扎肝右动脉，经肝左叶动脉插管，A、B组注射pDR2/TK质粒［溶于缓冲液(TE)中，1 g/L］，C、D组不注射pDR2/TK质粒，仅注射TE缓冲液。结扎肝左动脉。手术后第4 d，A、C组腹腔注射GCV［溶于生理盐水(NS)中，20 g/L］50 mg/kg体重，B、D组则给予NS每日2次，共7 d。第11 d分别取肝左、右叶组织，4%多聚甲醛固定6 h后石蜡包埋。

3.对pDR2/TK mRNA的检测：按试剂盒说明的方法用地高辛配体标记探针后，对组织切片进行原位杂交，3-溴-4-氯-5-吲哚磷酸盐/硝基四氮唑蓝(BCIP-NPT)染色及核固红衬染。pDR2/TK mRNA阳性细胞呈蓝色，阴性细胞则呈红色。阳性对照片取同一组织的相邻的另一切片，用未标记的探针进行原位杂交及染色。

4.对pDR2/TK基因表达的检测：用免疫组织化学ABC法^［1］。阳性细胞被染成黄色，阴性细胞为淡红色。每张切片观察8～10个高倍镜视野，累计阳性区域面积及总面积，计算其比值，即表达阳性率。

5.对杀伤效应的观察：切片苏木素-伊红(HE)染色，对照观察肝左、右叶组织变性及坏死程度。

6.统计学方法：肝左、右叶的差异性采用配对t检验，其余则采用两样本均数比较的显著性t检验。

结果

1.原位杂交：A组肝左叶坏死区内残存的肝细胞呈强阳性，周围肝细胞可见散在的阳性染色，肝右叶仅可见散在阳性肝细胞。B组左叶阳性肝细胞呈片状及点状，肝右叶阳性肝细胞呈散点状。A、B组的同组织阳性对照片同一区域均未见阳性染色。C、D组均未见阳性染色。

2.免疫组织化学：A组肝左叶坏死区残存的肝细胞呈强阳性，周围肝细胞可见散在阳性染色，肝右叶仅可见散在的阳性肝细胞，左叶肝细胞表达阳性率明显高于右叶［(4.34±1.43)%与(2.31±0.78)%，P＜0.01］。B组肝左叶阳性肝细胞呈大片状、灶状及点状，肝右叶阳性肝细胞仅呈灶状及散点状，肝左叶表达阳性率明显高于肝右叶［(4.86±2.13)%与(2.04±0.91)%，P＜0.01］。B组肝左叶表达阳性率略高于A组，差异无显著性(P＞0.05)，2组肝右叶表达阳性率差异亦无显著性(P＞0.05)。C组及D组均无阳性染色。

3.HE染色：A组肝左叶组织呈大片状及灶状坏死，主要位于肝小叶周边区，坏死灶内有大量单核细胞、中性粒细胞及少量多核巨细胞浸润，坏死区结构消失，仅可见残存的片状及单个肝细胞，但肝脏的网状支架尚存，并有少量纤维组织增生，部分肝叶出现肝淤血；肝右叶可见少量散在的点状及灶状坏死，周围有少量的炎性细胞浸润。B、C及D组左右肝叶未见明显的病理改变。

讨论

我们经一侧肝叶动脉将pDR2/TK基因导入大鼠肝内，通过原位杂交及免疫组织化学的方法检测其转录与表达，结果表明，转入pDR2/TK基因后在肝细胞内有HSV-TK mRNA转录及TK蛋白的表达。我们将较小容积、高浓度的pDR2/TK质粒选择性地导入大鼠肝左叶，使之仅位于肝左叶动脉及其分支血管床内，然后阻断肝动脉血流，以期基因局限在肝脏左叶内表达，结果表明，pDR2/TK基因在肝左叶的转录及表达明显高于肝右叶(P＜0.01)。应用GCV后肝左叶出现明显的肝细胞坏死，并有较重的炎性反应，而肝右叶仅有少许灶状及点状坏死，炎性反应轻微，两者差异有显著性(P＜0.01)。从而在一定程度上实现了pDR2/TK基因在1个肝叶内的靶向性表达与杀伤效应，配合使用GCV，可达到肝叶靶向性的杀伤效应。

pDR2/TK基因在肝右叶仍有一定量的表达，其表达率为(2.04±0.91)%，实验组肝右叶细胞也有一定程度的坏死，虽然较轻微，但仍值得注意。可能为质粒溢出血管床，坏死肝细胞释放出的基因进入血液循环，或旁观者效应所致。更有可能的原因是由于肝左叶动脉远端未加栓塞，质粒经动脉直接进入了血液循环，到达肝右叶所致。施行pDR2/TK基因夹心栓塞，有效地将质粒滞留于肝叶动脉及其分支血管床内，并且持续地释放至周围肝组织内，可能达到较好的表达靶向性与持续性，达到基因治疗应用于临床治疗肝癌的目的。

作者单位：詹勇强（430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）

吴在德（430030武汉，同济医科大学附属同济医院普外科）

参考文献

［1］方福德.周吕.现代医学实验技巧全书.第1版.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995.12：165-176.