第四军医大学学报1999年第20卷第5期

董茂龙陈璧徐明达苏映军汤朝武

摘要目的：探讨PDGF-AB促进伤口愈合的作用机理及其在瘢痕增生中的作用.方法：取体外培养的人正常皮肤及增生性瘢痕成纤维细胞(normal skin fibroblast, NSFB；hypertrophic scar fibroblast, HTSFB)测定生长曲线，用MTT法观察PDGF-AB对其增殖影响的差异.结果：两种细胞生长曲线存在差异，PDGF-AB对两种成纤维细胞增殖均有明显刺激作用，且均呈剂量依赖性关系，但作用有差异.结论：PDGF-AB可能通过刺激成纤维细胞增殖促进伤口愈合，同时在瘢痕增生性疾病中起重要作用.

关键词:血小板源生长因子-AB成纤维细胞MTT实验

0引言

血小板衍生生长因子 （PDGF）是由A，B两种单体构成的二聚体结构，可以形成PDGF-AA，AB，BB三种形式. 在人类血小板来源的PDGF中，约85%～90%为AB型，10%～15%为BB型^［1］. PDGF在创面愈合过程中起重要作用，特别是对一些慢性难愈性伤口如糖尿病溃疡、慢性静脉性溃疡、褥疮、放射性溃疡等均有明显促进愈合作用^［2，3］，但亦有越来越多的实验证明PDGF-AB与瘢痕等增生性疾病有关^［4，5］. 我们采用MTT法研究了PDGF-AB对成纤维细胞增殖的刺激作用，探讨其促进伤口愈合的机理及在瘢痕增生中可能的作用.

1材料和方法

1.1药品和试剂 PDGF-AB购于深圳晶美生物公司. DMEM为Gibco公司产品，胰蛋白酶为Dibco公司产品，新生小牛血清为上海产.

1.2成纤维细胞培养取术中剩下的人正常皮肤及增生性瘢痕，经2.5 mL/L洗必泰浸泡5 min消毒，生理盐水漂洗3次，剪成约1 mm × 1 mm × 1 mm大小，组织块法培养于含100 mL/L小牛血清的DMEM中，培养条件为37℃ 50 mL/L CO₂，每隔3 d换液1次，约4 d～6 d长出细胞，3 wk～4 wk长满瓶底，然后用1.25 mL/L胰酶+1 mL/L EDTA消化传代，取第3代～6代细胞用于实验. 取第1代或2代处于对数生长期的NSFB和HTSFB，常规消化、离心计数，用100 mL/L FCS的DMEM调整细胞浓度为1×10⁷/L，接种于24孔板，每孔接种1 mL，37.0℃，50 mL/L CO₂孵箱中培养，3 d换液1次，每日收集3孔细胞计数共10 d，取平均数在半对数坐标纸上绘制生长曲线.

1.3MTT试验取第3代～6代生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化、分离、收集细胞、细胞计数、及测定细胞活力，活细胞率达95%以上时，用100 mL/L FCS的DMEM调整细胞浓度为3×10⁷/L，按200 μL/孔接种于96孔板，于37℃，50 mL/L CO₂孵箱中培养12 h，待细胞贴壁后换成含PDGF-AB的DMEM, NSFB和HTSFB分别设置0, 1.25, 12.5, 25, 50及100 μg/L PDGF-AB+20 mL/L FCS的DMEM 6个浓度组，每组设置3个复孔，每一浓度重复3次，继续培养68 h，加MTT 20 μL/孔（5 g/L），继续培养4 h后弃去培养基，加二甲基亚砜100 μL/孔，微型振荡器上振荡15 min，在490 nm波长下用酶联免疫仪测定A值.

1.4统计学分析采用第四军医大学统计学教研室开发的SPLM医用统计软件包进行方差分析.

2结果

2.1细胞生长曲线细胞接种后1 d细胞数均降低，2 d均进入对数生长期，从曲线上看出HTSFB生长要比NSFB慢.

图 1NSFB和HTSFB生长曲线

fig 1Growth curves of NSFB and HTSFB

图 2PDGF-AB对NSFB和 HTSFB增殖的影响

fig 2PDGF-AB effects on the proliferation of NSFB and HTSFB

2.2MTT实验结果从曲线可以看出PDGF-AB对两种成纤维细胞均有明显促增殖作用，但在同一浓度时，对NSFB促增殖作用较HTSFB强，在100 μg/L时刺激作用反而有所下降. 注统计学处理为20 mL/L FCS对照组和PDGF-AB各浓度组的差别，增殖率=（实验组-对照组）/对照组×100%.

3讨论

3.1成纤维细胞生长曲线成纤维细胞传代细胞的生长过程分为三个阶段：早期细胞传代后进入生长缓慢的滞留阶段，以后为增殖迅速的指数生长期，最后到达生长停止的平台期. 本实验中观察到HTSFB和NSFB接种后经1 d～2 d的潜伏期后进入对数生长期，但二者生长曲线明显存在差异，HTSFB明显较NSFB生长缓慢. 虽然国内外学者对HTSFB和NSFB生长动力学研究报道不一，但越来越多的实验认为HTSFB和NSFB的生长增殖存在着显著的差异，特别是第3代以前的细胞，在3代以后随着HTSFB中细胞增殖表型的变化，可能是肌成纤维细胞数量的减少，增殖表型的FB数量的增加，到30代左右，HTSFB和NSFB的生长动力学差别越来越小^［6］，另一方面，HTSFB和NSFB在增殖表型上的差异，可以解释两种FB在创面愈合不同阶段的不同作用，即HTSFB可能主要为合成表型或收缩表型的FB，和后期创面修复、瘢痕挛缩有关.

3.2MTT实验本实验设置PDGF-AB 0,1.25,12.5,25,50, 100 μg/L 6个浓度组，观察到PDGF-AB对两种FB都有显著促增殖作用，且都呈现明显剂量依性关系，但剂量反应性存在着显著性差异. 对NSFB，PDGF-AB浓度为50 μg/L时，作用最强，而100 μg/L时促增殖作用反而有所下降，但对HTSFB而言PDGF-AB浓度为 100 μg/L时刺激作用最强，但增殖作用仍较NSFB弱（Fig 2），过低浓度（1.25 μg/L）PDGF-AB对两种FB增殖刺激作用均较小. 在相差显微镜下观察，经PDGF-AB作用的HTSFB及NSFB除细胞排列变密,细胞极性稍变乱之外,细胞形态无明显区别. 血小板衍生生长因子（PDGF）是创面愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程起重要作用，特别是作为间充质细胞（主要是FB）的主要有丝分裂原促进细胞增殖起作用，本实验结果和Warren等^［7］的实验结果相一致，证实了PDGF-AB对两种细胞的促增殖作用,但其作用的机制是多方面的，具体机理尚待进一步探讨.

作者简介：董茂龙，男，1971-10-31生，湖北省武穴市人，汉族，1995年第四军医大学医疗系本科毕业，1998年第四军医大学西京医院烧伤科硕士毕业，发表论文2篇. 导师陈璧. Tel：(029)3375297

作者单位：第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤外科， 陕西 西安 710033

参考文献

1 Russell R, Elaine WR,Daniel FB et al. The biology of platelet-derived growth factor. Cell,1986;46(3):155-169

2 Thomas FD, Rodney SK.Growth factor and wound healing: platelet-derived growth factor as a model cytokine. Annu Rev Med,1991;42(2):567-584

3 Martin CR,Linda GP, Arlen T et al.Platelet-derived growth factor BB for the treatment of chronic pressure ulcers. Lancet,1992;339 (8784):23-25

4 Bauriedel G, Kandolf R, Welsch U et al. Mechanisms of re-stenosis after angioplasty. Z Kardiol，1994;83(Suppl 40):31-41

5 Richard MT, William AJ, Richmond et al. The expression of PDGF in Dupuytren contracture. J Bone Joint Surg，1995;77(1):1-9

6 Jerry SVB, Rodolfph R, William LP et al. Coparative growth dynamics and actin concentration between cultured human myofibroblasts from granulating wounds and dermal fibroblasts from normal skin. US Can Acad Pathol,1989;61(5);532-538

7 Warren LG, Soverin K, Jorge LR et al. Phenotypic differences in cytokine resiveness of hypertrophic scar versus normal dermal fibroblasts. Society Invest Dermatol,1993;101(6):875-878