中华实验外科杂志2000年第17卷第3期

魏金星武玉东刘会凡马腾骧赵玉千吴长利

摘要目的探讨Fas配体(fas ligand, FasL)基因在肾细胞癌中的表达及临床意义。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学技术分别检测FasL mRNA及蛋白在51例肾细胞癌中的表达。结果51例肿瘤中32例FasL基因阳性表达。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级肿瘤中FasL的阳性表达率分别为25.0%、63.6%、88.2%；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ期肿瘤中FasL的阳性表达率分别为31.6%、76.2%、90.9%。FasL的阳性表达率在肿瘤病理分级及临床分期间差异具有显著性(P＜0.05)。结论FasL基因的表达在肾细胞癌的恶性进展中起重要作用。

关键词：肾肿瘤癌免疫组织化学

我们应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学技术检测肾细胞癌中Fas配体(fas lighand, FasL)基因的表达，探讨其在肿瘤恶性进展中的作用，现报道如下。

材料与方法

1.标本来源：51例肾癌组织标本取自本院及河南省平顶山市第一人民医院1997～1998年间经手术切除的肾癌组织标本，经病理证实为肾细胞癌。所有病例术前均未行化疗和放疗。每1例肿瘤标本分2份，1份经福马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片2张，1张行HE染色复查诊断，另1张进行免疫组织化学研究；另1份放入液氮冻存。Furhman分级：Ⅰ级12例、Ⅱ级22例、Ⅲ级17例；Robson分期：Ⅰ期19例、Ⅱ期21例、Ⅲ期9例、Ⅳ期2例。同时切取相应的正常肾皮质作对照。

2.RT-PCR检测FasL mRNA表达：应用异硫氰酸胍一步法从肿瘤组织中提取总RNA。RNA样品经逆转录反应合成FasL cDNA第1链，然后进行PCR扩增(PCR扩增仪为美国PE9600型)。RT-PCR扩增引物为FasL：5′-GGATTGGGCCTGG-

GGATGTTTCA-3′(S)及5′-TTGTGGCTCAGGGG-CAGGTTGTTG-3′(AS)，扩增产物为FasLcDNA特异的344 bp片段；β-actin:5′-GTGGGGCGCCCCAG-GCACCA-3′(S)及5′-GTCCTTAATGTCACGCAC-GATTTC-3′(AS)。引物设计横跨外显子拼节处，以避免扩增在RNA样品中可能存在的基因组DNA。反应条件为:50 μl反应体系中各引物终浓度为0.1 μmol/L，dNTPs各50 μmol/L，MgCl₂ 1.5 mmol/L，Taq酶1 U。94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，FasL共40个循环，β-actin共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。

3.免疫组织化学染色(SP法)：实验用兔抗人FasL多克隆抗体及SP免疫组织化学染色试剂盒为美国Santa Cruz生物技术公司产品。实验步骤按试剂盒说明书进行，一抗稀释度为1∶100。实验中以1例已经证实FasL阳性表达的食管癌标本作为阳性对照。为判断FasL抗体的真实染色强度，将已判断为阳性的组织切片随机抽样作空白对照实验，即以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗，其他步骤不变，以少于或大于对照组染色程度作为确定FasL阴性或阳性的标准。

结果

1.RT-PCR及免疫组织化学检测结果：RT-PCR结果显示，正常肾组织中未检出FasLmRNA的表达，51例肿瘤组织中32例存在FasLmRNA表达，FasLmRNA的RT-PCR扩增产物为344 bp片段(图1)，阳性表达率为62.7%。免疫组织化学结果证实FasL阳性表达为肿瘤细胞胞膜及胞浆黄色或棕黄色染色。

注：1～8为肿瘤组织，9为正常肾组织，10为PBR322/

Hinf肿瘤1、2、4、6、7、8 FasLmRNA阳性表达

1FasL基因在肾细胞癌中的表达

2.FasL基因阳性表达率在肿瘤病理分级间比较：FasL基因在Ⅰ级肿瘤中阳性表达3例，阳性表达率25.0%；Ⅱ级肿瘤中阳性表达14例，阳性表达率63.6%；Ⅲ级肿瘤中阳性表达15例，阳性表达率为88.2%。FasL基因的阳性表达率在肿瘤各级间比较，差异有显著性(P＜0.05)。

3.FasL基因阳性表达率在肿瘤临床分期间的比较：FasL基因在Ⅰ期肿瘤中阳性表达6例，阳性表达率31.6%；Ⅱ期肿瘤中阳性表达16例，阳性表达率76.2%；Ⅲ～Ⅳ期肿瘤中阳性表达10例，阳性表达率为90.9%。FasL基因的阳性表达率在肿瘤各期间比较，差异有显著性(P＜0.05)。

讨论

FasL与其受体Fas(APO-1、CD95)在维持机体免疫系统稳定中起重要作用，Fas为TNFR/NGR家族的跨膜蛋白，在不同来源的细胞上广泛表达，包括T、B淋巴细胞；而FasL仅在睾丸、眼等免疫赦免器官及一些肿瘤细胞上表达。FasL与表达Fas的T淋巴细胞结合可诱导其凋亡^［1］。最近的研究结果表明，将睾丸组织异体移植到肾被膜下可长期存活，这是由于睾丸Sertoli细胞高度表达FasL，而将睾丸组织移植到lpr小鼠(Fas基因突变)，则移植物被排斥；将胰岛与Sertoli细胞或转染FasL的成肌细胞共同移植，则可延长胰岛的生存时间^［2，3］。说明FasL的表达对移植物起免疫保护作用，这种作用是否存在于肿瘤的免疫逃避过程中 我们通过应用RT-PCR及免疫组织化学技术对肾细胞癌中FasL表达的检测发现，随着肿瘤病理分级及临床分期的增高，FasL的表达率明显增加，说明FasL阳性表达的肿瘤容易发生浸润进展。

肿瘤细胞表达FasL对机体免疫系统的影响不仅仅局限于肿瘤部位，可溶性FasL已在一些白血病及淋巴瘤中检出，这些可溶性FasL通过与激活的T淋巴细胞结合并诱导其凋亡，从而抑制其肿瘤杀伤作用。如果这种可溶性FasL在肾细胞癌患者血清中存在，则可能造成肿瘤病人细胞免疫反应的抑制。另外，肿瘤细胞表达FasL的影响并不仅仅局限在对免疫系统的相互作用上，FasL的表达还可通过诱导肿瘤周围Fas阳性表达组织细胞的凋亡，使肿瘤细胞利用周围这一空间发生浸润转移。

我们在实验中观察到的结果表明，少部分FasL阴性表达的肿瘤仍可发生浸润进展。由于肿瘤的免疫逃避与多种因素有关，如Ⅰ类主要组织相容性抗原(MHCI)抗原表达下调、缺乏B₇共刺激信号、以及分泌免疫调节蛋白转化生长因子-β(TGF-β)等，这些因素是否参与肾细胞癌的免疫逃避过程，尚需进一步研究证实。

基金项目：河南医科大学博士科研基金资助项目(HYY9705)

作者单位：魏金星（450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科）

武玉东（450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科）

刘会凡（450052郑州，河南医科大学第一附属医院泌尿外科）

马腾骧（天津市泌尿外科研究所）

赵玉千（天津市泌尿外科研究所）

吴长利（天津市泌尿外科研究所）

参考文献

［1］Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science, 1995,267:1 449-1 456.

［2］Bellgrau D, Gold D, Selawry H, et al. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection. Nature, 1995,377:630-632.

［3］Lau HT, Yu M, Fontana A, et al. Prevention of islet allograft rejection with engineered myoblasts expressing FasL in mice. Science, 1996,273:109-112.