第四军医大学学报1999年第20卷第8期

李福洋刘新平苏成芝张英起樊代明杨静华药立波

摘要目的： 重组表达angiostatin的功能结构域K1-3，并制备抗体，为其作用机理研究打下基础.方法： 设计引物，通过PCR以人纤溶酶原cDNA为模板扩增出K1-3基因片段，克隆至pGEX-4T-1融合表达载体，IPTG诱导，挑出表达克隆，切下基因片段，克隆至pUC19进行序列测定，保留序列完全正确的克隆并进行诱导表达；从SDS-PAGE上切下表达的蛋白条带作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体, 并以Western blotting检测抗血清的结合特异性.结果： DNA电泳结果显示PCR扩增出约780 bp的片段，序列测定表明为K1-3； K1-3可以与GST融合表达，产物存在于包含体中；抗血清与K1-3及煮沸变性的天然angiostatin特异地结合.结论： 经PCR扩增并克隆到序列正确的K1-3片段，而且能够以融合形式表达，用其免疫家兔获得特异性抗体.

关键词：重组融合蛋白质类血管生成抑制素

0引言

新生血管生成抑制因子的研究是抗肿瘤研究的一个热点. angiostatin是特异的新生血管形成抑制因子，由纤维蛋白酶原内部的4个同源性很高的环状赖氨酸结合结构域Kringle1-4 （K1-4）组成^［1］， 目前认为angiostatin是由纤溶酶原经体内特定的蛋白酶系水解而来. angiostatin无论在体内还是体外都显示出强而特异的新生血管形成作用，在抗实体肿瘤转移的治疗中显示出良好的应用前景，但其作用机理目前尚不清楚. 我们融合表达了K1-3片段，并制备了多克隆抗体，为其应用研究和作用机理研究打下基础.

1材料和方法

1.1材料人纤溶酶原cDNA由本校生物技术中心提供， pGEX-4T-1， pUC19载体及菌种均由本教研室保存. PCR引物由西安美联生物技术有限公司合成；Taq， dNTP， HRP标记驴抗兔系Promega公司产品，各种限制酶klenow酶及化学发光试剂盒均系宝灵曼产品，IPTG， 谷胱甘肽Argrose，福氏佐剂为Gibicol产品. 新西兰雄性大白兔由本校实验动物中心提供.

1.2引物设计利用计算机软件OLIGON和PCGENE进行辅助分析，分别设计出扩增K1-3的引物：

5′ primer： 5′-CGAATTCATGTATCTCTCAGAG-

TGCAAG-3′

3′ primer： 5′-CGGGATCCTCATTGTTCCGTGG-

ATACTGGGGA-3′

1.3扩增反应、 产物的克隆与测序变性温度：95℃，退火温度60℃，延伸时间90 s, 循环次数为35. 将PCR扩增产物回收，将K1-3以klenow酶补平，然后用EcoR I酶切，从EcoR I-Sma I位点连入pGEX-4T-1载体（命名为pGST-K1-3），转化DH5α感受态细胞，随机挑取多个克隆，37℃培养6 h， 0.4 mmol/L IPTG诱导3 h，收集细菌，进行十二磺基烷酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，挑出表达克隆，同时提取质粒，进行酶切鉴定，挑出含有能表达的K1-3片段的克隆，切下K1-3，克隆至pUC19，进行序列测定.

1.4K1-3的融合表达pGST-K1-3转入DH5α菌株，铺板培养，随机挑取2个～3个新鲜菌落，于细菌培养液（LB）中37℃摇床培养6 h， 0.4 mmol/L IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE分析.

1.5抗原的制备与免疫收集50 mL诱导表达5 h的细菌，超声破菌，初步纯化包涵体，再以 SDS-PAGE进一步分离纯化，从凝胶上切下相应的单一条带，磨碎，加完全福氏佐剂，混匀，免疫方法参照文献［2］.

1.6Western blotting方法参照文献［2］. 抗血清使用前加适量注射用结核菌素做中和反应，应用液作1∶100稀释. 显影采用化学发光法（ECL发光试剂盒）.

2结果

2.1PCR扩增结果PCR反应扩增出约780 bp片段(Fig 1)；将产物直接连入载体后诱导，SDS-PAGE蛋白电泳和质粒酶切分析显示部分带有PCR产物的重组体可表达出分子质量约为60 ku的蛋白(Fig 2)， 从中挑取一个克隆，将插段重新克隆到pUC-19载体进行测序. 表达重组体pGEX-4T-K1-3都可以EcoR I-BamH I切下约780 bp的片段(Fig 3)； pUC-19-K1-3以EcoR I-BamH I切下780 bp的片段（Fig 1）.

图1PCR产物和pUC-K1-3重组体酶切分析电泳图谱Fig 1Products of PCR restriction enzyme analysis of pUC-K1-3

Lane 1: Amplified K1-3 fragment by PCR； Lane 2: λDNA/HindⅢ-EcoR I；Lane 3: pUC19-K1-3/EcoR I-BamH I.

图2SDS-PAGE分析含有PCR扩增产物重组体的蛋白表达Fig 2SDS-PAGE analysis of the expression of recombinants containing PCR products

Lane 1: Protein marker； Lane 2～7: Expression protein of different clone induced by IPTG.

图3表达重组体PGEX-K1-3的酶切分析Fig 3Restriction enzyme analysis of clones expressing protein with molecular mass 60 ku

Lane 1: λDNA/HindⅢ-EcoR I； Lane 2～6: Recombinant plasmid/EcoR I-BamH I.

2.2K1-3的序列测定结果如Fig 4， 所扩增并克隆的784 bp片段系K1-3，序列完全正确.

图4K1-3基因的序列及其对应的氨基酸序列Fig 4The sequence of amplified K1-3

The underlined sequence are primers, the boxed are artificail initial code and terminal code, the shaded are kringle1, 2 and 3 domain respectively.

2.3GST-K1-3的表达IPTG诱导后含有重组表达载体的菌体表达出分子质量约为60 ku的蛋白GST-K1-3，该蛋白以不溶性包涵体形式存在，在裂解上清中未见其表达成分(Fig 5). 表达产率约占菌体总蛋白250 g/kg.

图5GST-K1-3表达的SDS-PAGE分析Fig 5SDS-PAGE analysis of the expression of GST-K1-3

Lane 1: Protein marker； Lane 2, 3, 4: Control； Lane 5: Expressed GST-K1-3; Lane 6: Suspension of lysis extract; Lane 7: GST-K1-3 in insoluble pellet.

2.4Western blotting结果显示免疫家兔制备的抗血清能与GST-K1-3重组蛋白特异性结合(Fig 6).

图6Western blotting分析抗血清对GST-K1-3的特异识别

Fig 6Western blotting assay of the recognition of anti-serum to GST-K1-3

A: SDS-PAGE of total protein. B: Western signal accordiing to GST-K1-3.

3讨论

Angiostatin是新生血管内皮细胞特异性的新生血管形成抑制因子，由纤溶酶原内部的4个Kringle结构（K1-4）组成， Cao等^［3］研究发现体外弹性蛋白酶有限水解纤溶酶原产生的K1-3活性比K1-4强. 我们采用PCR以人纤溶酶原cDNA为模板扩增得到K1-3，并将PCR产物直接克隆至pGEX-4T-1融合表达载体，IPTG诱导表达，挑出表达重组体，再做酶切鉴定，并将切下片段重新克隆至pUC19，进行序列测定，验证该扩增并克隆的片段系K1-3，而且序列完全正确. 本方法可避免常规先克隆测序后表达这一路线可能出现的额外工作量，例如PCR引起的无义突变或者是造成蛋白不表达的突变等，因而可缩短实验周期. 另外此策略可以通过高突变PCR用来筛选高表达或其它所需要的突变株.

K1-3可与GST融合表达，表达产物为包涵体. 我们同时也做了K1-3的非融合表达,其单独表达效率很低,但为可溶性表达. 目前我们尚在多方尝试以提高其表达水平. 以变性的GST-K1-3为抗原免疫家兔获得的抗血清特异性识别GST-K1-3和经煮沸变性的天然来源的K1-3，但不能识别天然未变性的K1-3.

关于angiostatin的作用机理，目前认为其主要