第四军医大学学报1999年第20卷第2期

司晓辉杨连甲金岩

摘要目的：探讨BMP对细胞分化的调节作用，为BMP基因疗法的建立提供依据.方法：构建了含有人BMP2开放阅读框(1.2 kb)的真核表达载体pBK-B2，利用脂质体转染方法将其导入NIH3T3细胞，通过G-418筛选获得阳性细胞克隆. 细胞原位杂交和免疫组化检测BMP2基因的稳定转染及表达情况.结果：转染细胞内有BMP2 mRNA 的转录及其蛋白的表达.结论：人BMP2基因在NIH3T3 细胞中得到稳定有效的表达.

关键词：骨形成蛋白2基因转染基因表达

0引言

骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）是一种高效骨诱导物质，在骨及牙齿的生长修复过程中发挥重要的作用，有着及其重要的研究价值和实用意义. BMP家族至少包括20个成员，其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子^［1］. 以BMP2基因为目的基因，以小鼠成纤维细胞为载体细胞，建立了稳定表达BMP2的细胞，为进一步从分子水平探讨BMP对细胞分化的调控作用奠定了基础，并为BMP基因疗法的建立提供了依据.

1材料和方法

1.1主要材料pSP65-BMP2克隆质粒由美国基因研究所Wozney博士惠赠，pBK-CMV噬菌粒表达载体（原核、真核均表达）由本校病理学教研室杨连君博士惠赠. 小鼠成纤维细胞株NIH3T3由本校免疫学教研室金伯泉教授惠赠. 限制性内切酶购自华美公司及Promega公司，Lipofectamine转染试剂盒购自东方科技公司，DMEM，G-418为美国Gibco公司产品. 鼠抗人BMP2单抗由本校生化教研室卢兹凡博士惠赠^［2］.

1.2pBK-B2表达载体的构建^［3］pBK-CMV和pSP65-BMP2分别经Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后，分别回收4.5 kb和1.2 kb的片段，用T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α，小提质粒进行酶切鉴定，阳性克隆命名为pBK-B2.

1.3基因转染和克隆筛选^［4］ 采用脂质体载体（Lipofectamine）将pBK-B2转染NIH3T3细胞. 转染3 d后，弃去原培养液，加入含G-418 500 ng/L 的DMEM培养液（含100 mL/ L FCS），在标准环境下培养，15 d后绝大多数细胞死亡，收集G-418抗性的细胞克隆，扩大培养并制备细胞爬片，固定于40 g/L多聚甲醛（PFA）/PBS (pH 7.4)中.

1.4原位杂交^［5］细胞爬片经3 mL/L Triton X-100/PBS，0.2 mol/L HCl及蛋白酶k处理，40 g/L PFA后固定及逐级酒精脱水干燥后，滴加热变性后的含地高辛标记BMP2探针的杂交液，42 ℃杂交过夜. 2×SSC，1×SSC，0.5×SSC充分漂洗，正常羊血清封闭，然后滴加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（Anti-DIG-AP）37 ℃温育2 h. Buffer Ⅰ，Buffer Ⅲ充分漂洗后，NBT/BCIP暗处显色20 h. TE终止反应，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.

1.5免疫组化^［6］细胞爬片经10 mL/L H₂O₂/PBS，3 mL/L Triton X-100/PBS处理后，滴加正常羊血清37 ℃温育30 min，弃去血清后滴加鼠抗人BMP2单抗，4 ℃过夜. 滴加生物素化的羊抗鼠IgG，37 ℃温育30 min，滴加ABC复合物37 ℃温育30 min，上述各步之间均以PBS充分振洗. 最后浸入新鲜配制的DAB显色液，室温10 min，蒸馏水洗终止反应，苏木精衬染，逐级酒精脱水后二甲苯透明，中性树胶封片.

2结果

2.1pBK-B2表达载体的鉴定pBK-B2经Sal I和Xba I双酶切，切出4.5 kb和1.2 kb的两条片段，表明构建成功(Fig 1).

2.2克隆细胞通过脂质体介导转染细胞，经G-418筛选，2 wk后得到抗性的细胞克隆，而亲本细胞在G-418培养液中1 wk内全部死亡，初步证明基因转染成功.

2.3原位杂交在转染细胞的胞浆中有蓝色颗粒样阳性杂交信号(Fig 2)，而亲本细胞为阴性，进一步证明pBK-B2成功导入细胞，并有mRNA的较高表达.

2.4免疫组化在转染细胞的胞浆中有棕色阳性信号(Fig 3)，而亲本细胞为阴性，证明人BMP2基因在NIH3T3细胞中得到表达.

图1pBK-B2真核表达载体的鉴定

fig 1Identification of pBK-B2 eukaryonic expression vector

1. λDNA/Hind Ⅲ marker；2. pBK-B2/Sal I-Xba I.

图2转染细胞胞浆呈BMP2 mRNA 阳性

Fig 2BMP2 mRNA positive signals in the cytoplasm of the transfected cells, ISH×200

图3转染细胞胞浆呈BMP2阳性

Fig 3BMP2 positive signals in the cytoplasm of the transfected cells

IHC, Haematoxylin counterstaining×200

3讨论

自1988年以来，已获得17种人BMP cDNA克隆，它们的存在范围及其广泛且具有高度的同源性. BMP2 cDNA全长1587 bp，编码396个氨基酸. 其5'端非翻译区约为340 bp，这对于cDNA在真核细胞中表达可能会产生影响，因此我们选择在cDNA起始密码ATG前2个bp处，用Sal I酶切，删除大部分5'端旁侧序列，并将此片段定向克隆于原核、真核均表达的pBK-CMV载体中.

通过基因转染方法研究某一外源基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段. 脂质体介导的基因转染方法是目前最常用的方法之一. 脂质体是内脂质双分子层组成的环状封闭囊泡，它可以和DNA形成脂类－DNA复合物，该复合物通过内吞方式入胞，从而使基因转入细胞. 此方法转染效率高，尤其是新一代产品Lipofectamine，对于一些难转染细胞（如COS-7, Hela, NIH3T3等）效率更高. 转染后100%的离体细胞可以瞬时表达外源基因.

将目的基因高效率地转移靶细胞并使之稳定表达是基因转移技术的关键，其检测方法通常为体外克隆形成实验，即转入载体（含Neo^R）的靶细胞能在G-418压力下生成抗性克隆^［4］. 本实验获得了稳定表达外源基因抗G-418的细胞克隆，通过核酸原位杂交、免疫组织化学检测，从mRNA水平及蛋白质水平证实了稳定转染后的NIH3T3细胞可以表达外源BMP2基因. 转染BMP2基因后细胞生物学行为的变化及其成骨能力的研究正在进行中.

BMP的异位成骨作用说明它可以诱导未分化间充质细胞向骨-软骨细胞分化，此外BMP还具有诱导肌源性细胞、成骨前体细胞等向骨细胞系分化的作用. 因此BMP在促进骨缺损和骨折愈合方面有着广阔的应用前景，尤其是在关节软骨等愈合能力差的组织及特殊部位的骨折^［7］. 随着分子生物学技术的不断发展，外源BMP基因的直接或间接导入和表达将会对局部骨缺损修复和某些骨疾病的基因治疗产生重要意义，并为BMP的临床应用开辟新途径.

作者简介：司晓辉，女，1970-12-10生，河北省石家庄市人，汉族. 1993年河北医科大学口腔系毕业，博士生，发表论文10篇. 电话：(029)3376152

作者单位：司晓辉杨连甲金岩第四军医大学秦都口腔医学院病理科陕西西安710033

参考文献

1.Riley EH,Lane JM,Urist MR et al.Bone morphogenetic protein-2: Biology and applications.Clin Orthop,1996; 324: 39-46

2.卢兹凡，胡传闽，陈苏民 et al.人骨形成蛋白2单克隆抗体的制备及鉴定.细胞与分子免疫学杂志，1997；13 (2)：32

3.萨姆布鲁克，E.F 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：35-56

4.姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1997：153-161

5.Si XH,Jin Y,Yang LJ et al.Expression of BMP-2 and TGF-β mRNA during healing of the rabbit mandible.Eur J Oral Sci,1997; 105 (4):325-330

6.司徒镇强，吴军正.细胞培养.西安：世界图书出版公司，1996：202-203

7.Fang J,Zhu YY,Smiley E et al.Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes.Proc Natl Acad Sci,1996;93 (12):5735-5738