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胡大海陈璧汤朝武苏映军王剑波金明贾赤宇徐明达
摘要 目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）基因导入正常角朊细胞后，能否表达及分泌hbFGF，并探讨其机理；为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础.方法：采用脂质体包埋hbFGF cDNA的真核表达质粒pcDNA3-hbFGF转染培养的人角朊细胞，经G418筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞. 用特异性neo探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的pcDNA3-hbFGF质粒载体；抗hbFGF抗体免疫细胞化学法观察转基因角朊细胞内hbFGF的翻译表达；选择人真皮成纤维细胞为效应细胞，应用抗体中和法分析转基因角朊细胞分泌hbFGF活性物质所引起的成纤维细胞增殖效应，了解hbFGF向胞外分泌情况.结果：pcDNA3-hbFGF可经脂质体介导有效地转入靶细胞角朊细胞内；用G418筛选纯化转基因后的角朊细胞内含转入的真核表达质粒pcDNA3-hbFGF，胞浆内有阳性hbFGF表达，并向胞外分泌hbFGF活性物质，刺激真皮成纤维细胞增殖.结论：含外源性hbFGF基因的角朊细胞可于体外纯化及扩大培养，并具有表达分泌 hbFGF的功能.
关键词: 基因转染成纤维细胞生长因子角朊细胞
0引言
随基因治疗的基础研究不断深入及完善，其应用日趋广泛［1,2］. 皮肤因其位于体表、组织结构、细胞组成等特点，在基因治疗应用方面显示了独自的潜力和前景［3，4］. 现代细胞生物学理论的发展及技术方法的成熟，使人们已能有效地从皮肤分离培养角朊细胞并将其再移植回创面，发挥覆盖创面促进愈合的治疗作用；但异体移值培养的角朊细胞只能暂时替代性覆盖创面，而自体移植则只适用于有一定真皮尚存的创面，否则将难获得理想的结果［5］. 生长因子如bFGF，TGF，EGF，PDGF等参与损伤后组织的再生、增殖、分化等过程，并在某些组织的再生过程中起关键性作用；因此，近年来成为组织修复领域的研究热点［6］. 然而临床治疗观察发现，其效应与达到有效的用药浓度及维持作用时间具有直接关系，人们尚不能找出理想的办法来解决这些问题，因而阻碍了其应用［7］. 本研究拟在应用已构建的真核细胞表达载体pcDNA3-hbFGF，转染体外培养的人角朊细胞，然后对其进行纯化及扩大培养，希望经体外转hbFGF基因获取具有主动持续分泌hbFGF功能的人角朊细胞，为临床开展创面基因治疗提供实验依据及物质基础.
1 材料和方法
1．1材料培养基：DMEM，K-SFM（Gibco）； 蛋白酶：胰蛋白酶（Difco）、Dispase酶（日本和光纯药株式社）、蛋白酶K（Sigma）；限制性核酸内切酶：HindⅢ，SalⅡ（Promega）；脂质体(lipofectamine)，2 g/L， G418， α-gal，20 g/L（Gibco）；DIG-DNA标记kit（Boehringer Manheim）； WizardTM Plus Milipres DNA纯化kit（Promega）；BCIP/NBT显色kit（Boster）； β-半乳糖苷酶染色kit（Gibco）；兔抗hbFGF（Santa Cru2 Biotechnology）；MTT（Sigma）. 质粒：①pcDNA3-neo，真核表达质粒，本校生化教研室惠宏囊副教授惠赠；②pcDNA3-hbFGF，含编码hbFGF 的cDNA，本科实验室构建；③pCMV-SPORT-β-gal，真核表达汇报质粒，含LacZ基因（Gibco）；④pBMG-neo：含位于酶切位点为SalⅡ与HindⅢ间的片段大小2.6 kb的neo基因（来源同①）.
组织标本来源:健康手术切除的包皮.
1.2方法
1.2.1细胞培养①人皮肤角朊细胞培养(Culture of human keratinocyte， Culture of HK)：按Rheinwald 等［8］的方法改进，分离及培养HK. 采用Dispase酶(1.25 g/L)冷消化，分离表皮；胰酶(2.5 g/L)热消化,制备细胞悬液；适当密度接种细胞，无血清HK完全培养基K-SFM培养，每3 d换液1次. ②人真皮成纤维细胞的培养(Culture of human dermal fibroblast, Culture of HDFib)：剪去表皮及皮下组织，切成＜1 mm3的真皮组织块，贴附于3.5 cm×6.5 cm的培养瓶底，加1.0 mL含100 mL/L FCS的DMEM，颠倒培养瓶培养4 h；补加培养基继续培养，每3 d换液1次；待细胞生长达约90% 融合时，胰酶消化；部分冻存，部分传代培养用于实验，整个研究中采用的HDFib系2代～4代.
1．2．2基因转染和克隆筛选培养达80% 融合的HK分组；采用脂质体lipofectamine介导将pCMV-SPORT-β-gal, pcDNA3-neo, pcDNA3-hbFGF分别转染细胞. 转染72 h后，转pcDNA3-neo, pcDNA3-hbFGF的HK，加入含G418的培养基，G418最高浓度为300 mg/L；2 wk后，出现小克隆，待克隆细胞生长至近融合时，传代扩大培养用于实验，部分冻存.
1．2．3细胞原位杂交细胞爬片用纯丙酮固定，行特异探针(neo基因片段) 原位杂交分析. ①neo探针的制备： pBMG-neo质粒转化宿主菌JM109，WizardTM Plus Milipres DNA纯化Kit提取并纯化质粒；采用SalⅡ/HindⅢ 双切纯化的pBMG-neo质粒，切下2.6 kb的片段即为neo基因片段，回收片段，紫外定量；②探针标记：按DIG-DNA标记Kit说明进行；③杂交主要过程： 在细胞爬片上加1 mg/L的蛋白酶K，37℃消化30 min后，三乙醇胺、乙酸酐、乙醇处理，空气干燥. 每张片子加杂交液100 μL，加硅化盖玻片，石蜡封闭，于密闭湿盒中50℃反应14 h. 滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体复合物，37℃孵育2 h. 按BCIP/NBT显色kit说明显色. 常规酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片，镜下观察.
1．2．4原位β-半乳糖苷酶染色转染pCMV-SPORT-β-gal组HK，于48 h后行原位β-半乳糖苷酶染色，按β-半乳糖苷酶染色kit说明进行. 观察HK对转入基因的表达能力并计算转染率.
1．2．5免疫细胞化学细胞爬片含正常、转染空载体pcDNA3-neo, 转染pcDNA3-bhFGF 的HK细胞组； 经10 mL/L H2O2处理后，加正常驴血清37℃温育20 min，甩去多余液体；加1∶50稀释的兔抗hbFGF抗体（阴性对照组加不含抗体的PBS)，每张片50 μL，湿盒内4℃过夜；1∶100稀释的DTAF标记驴抗兔IgG，湿盒内37℃反应30 min， 500 mL/L甘油(含25 g/L DABCO)封片，于激发光470 nm波长，荧光显微镜观察.
1．2．6免疫中和法测定转基因HK培养上清活性表达物①收集G418筛选的转基因HK培养上清，-20℃保存； ②用含100 mL/L FCS的DMEM调整细胞浓度为1×107cells/L，100 μL/孔接种96孔板，培养24 h； 换液改用5 mL/L FCS的DMEM，100 μL/孔，继续培养； ③用5 mL/L FCS的DMEM培养基配制含100 mL/L HK细胞培养上清、兔抗hbFGF及正常兔血清；后两种配制后均用0.22 μm微型滤器过滤，无菌备用；④将上述配制好的液体依次加于用5 mL/L FCS 的DMEM培养48 h 的含HDFib的96孔板各孔，100 μL/孔，每种液体加8孔，对照孔内只加5 mL/L FCS的DMEM，培养72 h.
1．2．7MTT测定加MTT(5 g/L)，20 μL/孔，培养4 h后弃上清， 加DMSO，100 μL/孔，微型振荡器上振荡，酶联免疫仪测定570 nm波长A值.
数据处理:全部数据均采用本校统计学教研室开发的SPLM医用统计软件包进行t 检验
2结果
2．1正常培养HK及转染后生长情况 正常培养原代及传代HK培养，其生长状况均良好，以3×105cells/瓶接种于3.5 cm×6.5 cm大小的培养瓶，K-SFM培养基培养1 wk即可达80%融合，满足转染需求(Fig 1). 转染后72 h细胞生长达100%融合，细胞形态良好（Fig 2）.
图 1正常人角朊细胞培养后7 d，达80%融合，可用于转染
Fig 1In 7 d culture, the normal human keratinocytes grew to about 80% confluence, ready for gene transfection ×100图 2转染HK细胞培养72 h外观
Fig 272 h after tansfected with pcDNA3-hbFGF, keratinocytes grew to about 100% confluence ×100
2．2原位β-半乳糖苷酶染色示转染HK细胞情况应用pCMV-SPORT-β-gal作为汇报质粒(Fig 3)检测该实验转染系统，显示其转染外源真核表达质粒转染率较高，约30%；转染后HK细胞生长状况良好，具有强的外源目的基因表达(Fig 4).
2．3应用特异neo探针细胞原位杂交结果结果显示转染pcDNA3-neo空载体及pcDNA3-hbFGF并经G418筛选后的HK细胞内均有载体质粒存在，对照组HK细胞则呈阴性；载体所处位置在胞浆近核膜周围（Fig 5～7）.
