第四军医大学学报1999年第20卷第8期

赵正源王云杰刘锟程庆书王春梅

摘要目的： 观察兔急性实验性反流性食管炎与正常兔食管体部平滑肌细胞内钙离子浓度的变化.方法： 20只成年新西兰大白兔（体重1.5 kg～1.8 kg）随机分成两组. 一组用0.1 mol/L HCl在距食管下括约肌(LES)上方6 cm处连续灌注兔食管4 d，1 mL/min，30 min/d. 用牵拉式方法在腔内测定灌注前与灌注后LES上方5 cm处食管内压. 急性分离食管体部距食管下括约肌上方5 cm处平滑肌细胞制成细胞悬浮液. Flou-3做为钙指示剂，共聚焦显微镜分别测定细胞内钙［Ca²⁺］i.结果： 正常兔食管体部平滑肌细胞内钙浓度为(134.6±4.03) nmol/L. 急性实验性反流性食管炎兔食管体部平滑肌细胞内钙浓度为(113±5.90) nmol/L. 统计学处理（P＜0.01）有显著统计学差异. 食管压力灌注前(0.064±0.0176) kPa，灌注后-(0.035±0.0176) kPa (P＜0.01)有显著统计学差异.结论： 急性实验性食管炎兔食管体部平滑肌细胞内钙浓度明显低于正常食管体部平滑肌细胞.

关键词：食管炎食管平滑肌细胞胞内钙Fluo-3

0引言

返流性食管炎是影响10%的儿童及成人的一种常见的疾病. 并且如果不治疗可以导致慢性食管炎、呼吸性肺炎、食管狭窄和Barrette's食管及癌前病变. 返流性食管炎是多因素的疾病，与之有关的因素有食管下括约肌短暂的松弛、食管清除的速度、粘膜下电位差和其他因素，以上诸多因素与食管及食管下括约肌的粘膜下平滑肌细胞的功能密切相关^［1，2］. 我们采用实验性兔返流性食管炎模型体部平滑肌细胞与正常食管平滑肌细胞内Ca²⁺的分布的实验研究，观察实验组与正常组细胞内Ca²⁺的分布的情况，予期对返流性食管炎食管功能变化产生的机理，特别是细胞第二信使在其中所起的重要作用有进一步的了解.

1材料和方法

1.1试剂Hank's液(mol/L)： NaCl 0.14， KCl 0.0005， MgSO₄·7H₂O 0.0008， Na₂HPO₄·12 H₂O 0.0004， KH₂PO₄ 0.0004， D-Glucose 0.0056， CaCl₂ 0.0013， NaHCO₃ 0.0042. Hank's液采用国产分析纯试剂和超纯水（18.2 MΩcm）配制. 超纯水由本校口腔医学院牙体生物学科提供. Fluo-3/AM为美国BIO-RAD产品. 胰蛋白酶购自华美生物工程公司.

1.2仪器Manometer for Digesting Tract Motility／Institute of Space Medical Engineering／LM17记录仪-永青示波器厂，西安医科大学第二附属医院食管功能研究室.

1.3急性实验性返流性食管炎模型的建立参考Biancani等^［1,3］的方法，用20只成年新西兰大白兔体质量3 kg～3.5 kg（第四军医大学实验动物中心）随机分成2组，第一组为实验组，第二组为对照组. 实验组用846麻醉剂0.1 mL/kg麻醉后，使兔仰卧固定于手术台上. 使用腔内牵拉导管的方法测定兔食管全长的压力，找出压力最高处，此处为LES位置所在，测定LES上方5 cm处的食管腔内压力并记录，向上到达6 cm处固定三腔管. 0.1 mol/L HCl 1 mL/min，灌注30 min/d，连续灌注4 d. 灌注完成后在距LES上方5 cm处再度测定食管腔内压力并记录. 对照组采用同样方法麻醉后，使用生理盐水同样方法进行灌注，分别测定灌注前后食管腔内压力同时记录. 测压完成后，经胸正中切口解剖动物，取从胃食管连接处向上5 cm的食管下段肌肉组织，长5 cm，宽3 cm，仔细去除食管粘膜及浆膜，保留平滑肌组织. 用30 mL/L戊二醛固定组织后，分别对标本进行光镜及电镜下的观察.

1.4游离平滑肌细胞悬浊液制备分别将实验组和正常组实验动物兔解剖显露食管，锐性分离食管，去除食管粘膜及外层浆膜保留平滑肌层. 剪碎、碾磨后加入胰蛋白酶37℃下消化细胞40 min. 加入D-Hanks液终止消化，D-Hanks液冲洗、 1 500 r/min离心3遍，置入温箱以备负载Fluo-3^［2,4,5］.

1.5平滑肌细胞内钙离子的测定用Fluo-3/AM分别负载的实验组和正常组食管体部平滑肌细胞，在共聚焦显微镜（本校中心实验室，MRC-1024，BIO-RAD）下动态扫描细胞内钙荧光强度变化，激发波长488 nm，发射波长526 nm. ［Ca²⁺］由下面公式得出，［Ca²⁺］=kd·［(F-F_min)/(F_max-F)］，kd是Fluo-3与Ca²⁺反应的解离常数，kd=400 nmol，F为所测到的荧光光密度值，F_max和F_min分别为Ca²⁺饱和后和零钙时的荧光光密度值.

1.6细胞存活率检测用台盼蓝排斥实验检测细胞存活率. 先将细胞制备成1×10⁶/mL的单个细胞悬液，再取9 μL细胞悬液移入小试管中，加1 μL 4 g/L台盼蓝溶液混匀，在3 min内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，得出细胞率均为98%.

1.7实验数据的处理数据均用X±s表示，数据分析软件为SPSS软件.

2结果

2.1实验性食管炎食管体部平滑肌细胞的形态改变光镜下： 正常食管平滑肌束呈内环、外纵排列，细胞大小形态正常，肌纤维之间无炎性细胞浸润；实验性食管炎食管体部平滑肌肌纤维之间有大量炎性细胞浸润，血管内充血，少部有肌纤维溶解，均质（Fig 1, 2）. 电镜下：正常食管平滑肌细胞内线粒体结构完整，嵴结构正常，微丝排列整齐，走向一致；实验性食管炎平滑肌细胞内线粒体固缩，嵴融合，微丝走向不一致（Fig 3, 4）.

图1正常食管平滑肌Fig 1Normal esophageal smooth muscleHE×40

图2食管炎平滑肌纤维间炎性细胞浸润Fig 2In esophageal smooth muscle of esophagitis have inflammatory cellHE×40

图3正常食管平滑肌细胞内线粒体结构完整，嵴结构正常，微丝排列整齐Fig 3In normal esophageal smooth muscle cell, mitochondrion structure integrity, microfilament put in orderTEM ×15 000

图4食管炎平滑肌细胞内线粒体固缩，嵴融合，微丝走向不一致

Fig 4In smooth muscle cell of esophagitis, mitochondrion pycnosis, microfilament indistinctTEM×40 000

2.2实验性食管炎食管体部压力测定的结果食管体部测定的压力有明显差异： 灌注前(0.064±0.0176) kPa，灌注后-(0.035±0.0176) kPa （P＜0.01）.

2.3正常兔食管体部平滑肌与实验性食管炎食管体部平滑肌细胞内钙的变化正常兔食管体部平滑肌细胞内钙含量平均为(134.6±4.03) nmol/L. 实验性食管炎食管体部平滑肌细胞内钙含量平均为(113±5.90) nmol/L （P＜0.01）

3讨论

返流性食管炎产生的病理和生理学基础为食管下端过多或过久的暴露在胃液中造成食管粘膜和平滑肌的损伤，常见的原因有食管下括约肌功能的障碍；食管的清除能力下降；唾液的冲洗作用减低等. 所有因素中食管的清除能力是至关重要的环节. 而食管下段体部平滑肌细胞本身的功能决定了食管的清除能力. 我们在实验性食管炎的动物模型中通过测定食管体部平滑肌细胞内钙离子的浓度，与正常动物模型作对比，结果显示：实验性食管炎食管体部平滑肌细胞中的钙离子浓度明显低于正常食管体部平滑肌细胞内的钙离子浓度. 这一实验结果与Stephen等实验结果相似^［2］.

由于食管炎使平滑肌细胞内的钙离子浓度的降低，细胞对正常激动剂刺激的反应程度降低^［1,2］，从而引起细胞的收缩功能减低，难以维持正常的食管腔内压力，导致实验性食管炎食管体部食管清除功能较正常食管明显减弱. 这一点我们在实验中证明食管炎食管腔内压明显低于正常食管腔内压.

Ca²⁺是细胞内最普遍而重要的信号转导成分. 静息状态下，细胞内游离Ca²⁺浓度（［Ca²⁺］i）约为细胞外的1/20 000. 细胞在激动的情况下，［Ca²⁺］i呈双相升高^［6,7］. 目前大多数学者认为虽然在非兴奋细胞（如平滑肌细胞）钙离子作用的机制与自律细胞是不同的，但钙离子仍然是平滑肌细胞收缩中非常重要的第二信使.

Biancani等^［1］通过实验指出实验性食管炎中食管的腔内压明显低于正常对照组，细胞内钙含量明显降低，同时对乙酰胆碱诱导产生的收缩，需要使用大剂量的乙酰胆碱才能诱发. Harlan等^［4］指出食管炎细胞内钙离