湖南医科大学学报1999年第24卷第1期

肖志强关勇军段朝军陈主初姚开泰

提要为制备EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因转基因小鼠，探讨LMP的体内致瘤作用，本文构建了三种不同的LMP基因转基因载体，即pBR322-MT-LMP，pMci3-LMP和pMV-LMP-c-myc；并分别讨论了上述三种载体的特征及其应用前景。

关键词：EB病毒潜伏膜蛋白转基因载体

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是一种与人Burkitt's淋巴瘤和鼻咽癌等密切相关的DNA肿瘤病毒。大量研究表明，EBV的瘤基因为潜伏膜蛋白(Latent membrane protein, LMP)基因，其编码产物LMP在体外可引起多种细胞转化甚至致瘤，但对LMP在体内的致瘤作用目前仍知之甚少^［1～3］。制备LMP基因转基因小鼠，对于进一步阐明LMP的体内作用及其与肿瘤发病的关系具有重要意义。制备转基因小鼠的关键是转基因能够表达，最好是能组织特异性地表达，而基因的表达特征主要由基因的调控序列(启动子/增强子)所决定^［4，5］。因此，选择合适的基因调控序列构建转基因载体是制备转基因小鼠首先要解决的问题。本文用不同的基因调控序列与EBV LMP的结构基因相连，分别构建了三种不同的LMP基因转基因载体，为制备LMP基因转基因小鼠奠定了坚实的基础。

1材料与方法

1.1材料pCMV_α-LMP及pMV-c-myc质粒分别从英国和美国引进；pBR322-MT及pMci3质粒分别由北京大学生物系和复旦大学遗传所提供；E.coli受体菌株HB101为本所保存。分子生物学试剂如限制性核酸内切酶、小牛肠碱性磷酸酶(CIP)和T4 DNA连接酶购自GIBCO公司。其它常用试剂为国产分析纯。

1.2方法质粒DNA的提取、酶切、电泳，酶切片段的回收、连接、转化及转化子的酶切鉴定均按文献^［6］的方法进行。

2结果

2.1pBR322-MT-LMP载体的构建pBR322-MT-LMP载体的构建过程如图1。即用BamHⅠ酶切9.14kb pCMV_α-LMP质粒，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离、回收3.2kb含LMP基因的BamHⅠ酶切片段；并用Bge1Ⅱ和BamHⅠ双酶切8.16kb pBR322-MT质粒，去掉鼠金属硫蛋白(Metallothionein, MT)结构基因，同时回收5.8kb pBR322-MT载体片段(该片段含鼠MT基因调控区和pBR322质粒部分)。载体片段经CIP处理后，通过T4 DNA连接酶与3.2kb含LMP基因片段相连。连接物转化E.coliHB101获得重组体转化子，小量扩增后快速抽提质粒DNA并酶切鉴定。结果如下：EcoRI酶切证实重组体含2.4kb LMP基因片段(图2)；SalⅠ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入酶切后有1.0kb和8.0kb的带，而反方向插入有2.7kb和6.3kb的带(图3)。说明已获得两种LMP基因分别以正、反方向与鼠MT基因调控区相连的大小约为9.0kb的pBR322-MT-LMP载体。

图1pBR322-MT-LMP载体构建图图2EcoRI酶切pBR322-MT-LMP载体1.pCMV_α-LMP质粒，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因片段2.λDNA/Hind Ⅲ marker3.pBR322-MT-LMP载体，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因片段图3

SalⅠ酶切pBR322-MT-LMP载体1.pBR322-MT-LMP载体，未酶切2.pBR322-MT-LMP载体，SalⅠ酶切为1.0kb和8.0kb两条带，示LMP基因正方向与MT基因调控区相连3.ΦX 174/Hae Ⅲ marker

Fig.1Construction of pBR322-MT-LMP vectorFig.2EcoRI digestion of pBR322-MT-LMP vector1.pCMV_α-LMP plasmid, EcoRI digestion displays 2.4kb LMP gene fragment.2.λDNA/HindⅢ marker3.pBR322-MT-LMP vector, EcoRI digestion displays the insertion of 2.4kb LMP gene fragment.Fig.3SalⅠ digestion of pBR322-MT-LMP vector1.uncut pBR322-MT-LMP vector2.pBR322-MT-LMP vector, SalⅠ digestion displays two bands of 1.0 and 8.0kb, indicating LMP gene positively links to the regulation region of MT gene.3. ΦX 174/HaeⅢ marker

2.2pMci3-LMP载体的构建pMci3-LMP载体的构建过程如图4所示。简言之，分别用BamHⅠ酶切9.14kb pCMV_α-LMP质粒及11.4kb pMci3质粒，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱法回收3.2kb含LMP基因片段和9.1kb pMci3载体片段。其中载体片段含EBV复制起始区(oriP)，EB病毒核抗原-1(EBNA1)基因，潮霉素阻抗基因(Hyg^r)及pBR322质粒部分。经CIP处理(防止载体自身环化)后，两片段如前所述进行连接和转化，所得的重组体转化子酶切鉴定的结果为：BamHI酶切证实重组体含3.2kb LMP基因片段(图5)；SalⅠ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入切得2.4kb和9.9kb的带，而反方向插入切得1.0kb和11.3kb的带(图6，7)。说明获得了两种LMP基因正或反方向与EBV oriP相连的大小约12.3kb的pMci3-LMP载体。

图4pMci3-LMP载体的构建图5BamHI酶切pMci3-LMP载体1.pMci3-LMP载体，BamHI酶切有3.2kb LMP基因片段2.λDNA/HindⅢ marker3.pMci3质粒，BamHI酶切有2.3kb lacⅠ基因片段图6SalⅠ酶切pMci3-LMP载体1.λDNA/HindⅢ marker2,3,4. pMci3-LMP载体，SalⅠ酶切有2.4kb和9.9kb两条带，示LMP基因正方向与EBV oriP相连图7SalⅠ酶切pMci3-LMP载体1.ΦX174/HaeⅢ marker2,3. pMci3-LMP载体，SalⅠ酶切为1.0kb和11.3kb两条带，示LMP基因反方向与EBV oriP相连

Fig.4Construction of pMci3-LMP vectorFig.5BamHI digestion of pMci3-LMP vector1.pMci3-LMP vector, BamHI digestion displays 3.2kb LMP gene fragment2.λDNA Hind/Ⅲ marker3.pMci3 plasmid, BamHI digestion displays 2.3kb lacⅠ gene fragmentFig.6SalⅠ digestion of pMci3-LMP vector1.λDNA/HindⅢ marker2,3,4.pMci3-LMP vectors, SalⅠ digestion displays two bands of 2.4 and 9.9kb, indicating LMP gene positively links to EBV oriP.Fig.7SalⅠ digestion of pMci3-LMP vector1.ΦX174/HaeⅢ marker2,3. pMci3-LMP vector, SalⅠ digestion displays two bands of 1.0 and 11.3kb, indicating LMP gene negatively links to EBV oriP.

2.3pMV-LMP-c-myc载体的构建pMV-LMP-c-myc载体的构建过程如图8。首先用EcoRI酶切9.5kb pMV-c-myc质粒将其线性化，该质粒含人c-myc基因cDNA；然后用EcoRI酶切9.14kb pCMV_α-LMP质粒，琼脂糖凝胶电泳分离，电洗脱法回收2.4kb含LMP结构基因的EcoRⅠ酶切片段。线性化的pMV-c-myc同样经CIP处理后，与2.4kb含LMP基因的EcoRI片段连接，连接物转化E.coli HB101，获得的重组体转化子用EcoRI和Bg1Ⅱ酶切鉴定。其中，EcoRI酶切发现有2.4kb含LMP基因的插入片段(图9)；Bg1Ⅱ酶切有两种构型，LMP基因正方向插入酶切得4.3kb和7.6kb的带，而反方向插入酶切得2.9kb和9.0kb的带(图10)。说明已获得正、反方向插入的两种大小约11.9kb的pMV-LMP-c-myc载体。

图8pMV-LMP-c-myc载体的构建图9EcoRⅠ酶切pMV-LMP-c-myc载体1.λDNA HindⅢ marker2.pMV-c-myc质粒，EcoRI酶切将其线性化3.pMV-LMP-c-myc载体，EcoRI酶切有2.4kb LMP基因插入片段图10Bg1Ⅱ酶切pMV-LMP-c-myc载体1.λDNA HindⅢ marker2.pMV-LMP-c-myc载体，Bg1Ⅱ酶切为4.3kb和7.6kb两条带，示LMP基因正方向与5′LTR相连3，4.pMV-LMP-c-myc载体，Bg1Ⅱ酶切为2.9kb和9.0kb两条带，示LMP基因反方向与5′LTR相连

Fig.8Construction of pMV-LMP-c-myc vectorFig.9EcoRI digestion of pMV-LMP-c-myc vector1.λDNA/HindⅢ marker2.pMV-c-myc plasmid, EcoRI digestion displays only 9.5kb band3.pMV-LMP-c-myc vector,