第三军医大学学报1999年第21卷第12期

陈自强卞修武辛榕殷育松

提要目的：建立一人脑胶质瘤细胞系并探讨其生物学特性。方法：取胶质瘤新鲜手术标本，经组织块法培养并克隆、建株，采用光镜、电镜、免疫组化、流式细胞术、染色体分析及异种移植瘤实验对细胞株生物学特性进行观察。结果：原位肿瘤、细胞株及移植瘤标本经电镜证实为星形细胞源性，免疫组化呈GFAP、Vimentin及VEGF阳性，异种移植成瘤率高。与SHG-44细胞比较，GFAP表达强，Vimentin表达弱。结论：CHG-5为一恶性胶质瘤细胞系，且其生物学特性可能与SHG-44细胞有所不同。该细胞高表达血管生成因子。

关键词：胶质瘤细胞系细胞体外培养

胶质瘤是常见的脑肿瘤之一，其病因及生长因素与其他肿瘤一样尚不清楚。对胶质瘤的深入研究需要建立一系列具有不同生物学特性的胶质瘤细胞系。目前国内外报道的胶质瘤细胞株已有近10种，其中国外较多，所使用的胶质瘤细胞系主要包括人胶质母细胞瘤细胞系^［1］和大鼠胶质瘤细胞系(如C6)，这些细胞大多呈GFAP低表达^［2］。国内目前人体胶质瘤细胞株有SHG-44(苏州)、TJ105(天津)、XHG-92(西安)等，其中以SHG-44细胞的生物学特性报道最多,它是胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级^［3］；XHG-92目前已失传。为了进一步探索胶质瘤的特性并满足实验研究的需要，我们建立了来源于人脑胶质瘤的细胞系，并进行了克隆，建立了CHG-5细胞株，探讨了其部分生物学特性。

1材料与方法

1.1标本来源与细胞培养方法肿瘤取自我校附属西南医院脑外科手术标本，患者男性，29岁，病理诊断为右额叶混合型胶质瘤(星形细胞和少突胶质细胞瘤)Ⅱ级。石蜡切片上进行GFAP免疫组化染色，并进行电镜制样和观察。参照文献［4］进行组织块法培养，使用含10%小牛血清的PRMI 1640培养基。传至第24代时用无限稀释法进行克隆，然后每隔5代冻存1批，每隔2月复苏1支。3～5 d传代1次，1～3 d换液1次。

1.2形态学观察

在倒置显微镜下观察培养中的活细胞。传代时将部分细胞传于盖玻片上，3～5d后，用75%酒精室温固定，HE染色；移植瘤取部分常规石蜡制片，HE染色；细胞及移植瘤均常规电镜制样，透射电镜观察。

1.3细胞动力学和遗传学特征检测

生长曲线：将第45代细胞制成悬液后计数，然后平均分配于12个25 ml培养瓶中，每天取1瓶观察并计数，绘制出生长曲线，求得细胞群体倍增时间。

细胞周期测定：取培养72 h的细胞,制成悬液，离心后用pH 7.0的0.01 mol/L PBS洗，再离心，用70%酒精固定后，碘化丙锭(PI)染色，FACStar^plus型流式细胞仪检测细胞倍体及细胞周期，测出各期百分比。

染色体G显带分析：取培养72 h的细胞加入秋水仙素(终浓度为0.06 μg/ml)，再培养6 h后，收集细胞，离心，弃上清，逐滴加入0.75 mol/L KCl，37℃低渗40 min；加入3∶1甲醇室温固定30 min×2，滴片，自然干燥后Giemsa染色，油镜检查。

异种种植：将第41代细胞制成悬液后,分别接种于2只BALB/B nu/nu裸小鼠胸、腹皮下，2周后观察，有皮下结节形成者为阳性。待结节长至直径约1.5～2.0 cm时，取结节行光、电镜及GFAP、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)、FGF受体(FGFR)、血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫组化检查，并将部分结节研磨后再接种于另2只BALB/B nu/nu裸小鼠胸、腹皮下，如是传代，已传5代。

1.4免疫组化染色

将生长于盖玻片上的细胞用75%酒精固定40 min后，晾干，一分为九，用中性树胶粘贴于载玻片上，常规LSAB法进行，一抗分别为GFAP、Vimentin、VEGF、bFGF、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和S-100蛋白。

2结果

2.1形态观察和免疫组化结果

原位瘤组织学见部分区域瘤细胞呈圆形、椭圆形、星形，胞浆中等，嗜酸性。胞核呈圆形、卵圆形，瘤细胞弥散分布。部分区域瘤细胞以圆形为主，胞浆较少，核周有空晕。透射电镜见部分瘤细胞突起较多，胞质内有较多的中间丝；部分瘤细胞突起少，核较圆，胞浆内细胞器较少，缺乏中间丝。血管内皮细胞间缝隙增宽。免疫组化见部分瘤细胞呈GFAP阳性。

培养瘤细胞在倒置显微镜下有3种形态：圆形、星形和梭形，星形细胞一般有3～4个突起，胞浆中等、较暗，核较亮，圆形、椭圆形各约1/2。传代后1～2 d内，圆形细胞较多，以后梭形细胞较多，培养时间越长，梭形细胞越多，再次传代后，重复上述形态演变。生长5 d的细胞，圆形、星形与梭形细胞均可见，以梭形细胞为主，胞浆中等，且核以圆形占优势，深染，核分裂像不易见。透射电镜观察：可见较多微绒毛及大量内质网，游离核糖体和较多的线粒体，中间丝不明显，部分细胞可见明显的脂滴。免疫组化染色见瘤细胞胞浆呈GFAP(见图1)及iNOS强阳性，VEGF(见图2)及bFGF、S-100蛋白阳性，vimentin弱阳性。

图1CHG-5细胞胞浆呈GFAP染色阳性(LSAB×200)

fig 1Positive staining for GFAP antibody in the cytoplasm of CHG-5 cells(LSAB×200)

图2CHG-5细胞胞浆呈VEGF染色阳性(LSAB×200)

fig 2Positive reaction of VEGF in the cytoplasm of CHG-5 cells(LSAB×200)

异种种植实验可见第1、2只2周后注射部位均有皮下结节形成。瘤的大小与接种细胞数量呈正相关。瘤结节研磨后再接种裸鼠仍有皮下结节形成，且越往后传，出现皮下结节时间越短。

移植瘤组织学表现为瘤细胞弥散分布，呈圆或椭圆形，胞浆中等，核圆或椭圆形，深染，可见核分裂像，见图3。电镜下见细胞可见短的突起，核不规则，细胞器以线粒体为主，中间丝不明显，见图4。免疫组化见其部分瘤细胞胞浆呈VEGF、bFGF、S-100蛋白阳性，GFAP弱阳性。

图3移植瘤瘤细胞呈圆形或椭圆形，核深染(HE×200)

fig 3Round or oval glioma cells with anaplastic

nuclei in the xenograft(HE×200)

图4电镜下移植瘤细胞可见短的突起(→)，核不规则，细胞器以线粒体为主，中间丝不明显(TEM×6000)

fig 4Glioma cells with irregular nuclei and short processes, many mitocondria in cytoplasm while intermediate filaments not obvious(TEM×6000)

2.2细胞动力学和遗传学特征

接种后，第1、2天细胞增殖较慢，第3、4、5天细胞数目直线上升，第6天以后细胞重叠生长，数目无明显变化。细胞群体倍增时间约为39 h。细胞增殖周期约为49.6 h。流式细胞仪测得G₁期占70.9%；S期占26.3%；G₂＋M期占2.8%。

染色体检查，显示二倍体占36%，三倍体占45%，超三倍体占19%。

3讨论

3.1CHG-5细胞的生物学特性我室以往的研究显示，SHG-44细胞具有低表达GFAP、高表达Vimentin的特性，表明其分化很低。本文报告的CHG-5细胞株，经过1年多的体外培养，现已传至第76代，各种生物学特性相对比较稳定。

GFAP一直被视为星形细胞及其肿瘤的特异标记物，在诊断及鉴别诊断上具有重要价值。GFAP可与Vimentin共同表达于星形细胞肿瘤中，前者与分化程度呈正相关，后者与分化程度呈负相关。二者的表达水平也有助于分析胶质瘤的预后情况。目前国内外研究者常将GFAP的表达水平做为胶质瘤诱导分化的最可靠指标^［5，6］。

本系细胞免疫组化示GFAP强阳性，S-100蛋白阳性，表明其为星形细胞源性肿瘤。与SHG-44细胞相比，形态上略有差异：圆形核增多，梭形细胞较SHG-44细胞短、少；且GFAP表达明显较SHG-44细胞强，表明此细胞分化程度较高；这为更加深入地研究胶质瘤提供了较好的实验材料。异种移植实验更证明了本系细胞的恶性特征。

3.2血管生成因子表达情况及其意义

血管生成在肿瘤生长中的作用已得到普遍共识。VEGF和bFGF除表达于一些已血管化的组织和胚胎组织及伤口愈合过程中外，还表达于很多原位瘤组织和细胞系^［7］，其过度表达可使肿瘤生长加