第四军医大学学报1999年第20卷第5期

胡大海陈璧汤朝武苏映军惠宏襄阎小君贾赤宇徐明达

摘要 目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）基因真核表达质粒，为深入研究hbFGF在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础.方法：含hbFGF cDNA的pUC18-hbFGF质粒于大肠杆菌JM109内扩增；提取及纯化pUC18-hbFGF质粒；经DNA序列分析所含hbFGF cDNA；限制性酶切hbFGF cDNA片段，连接酶连接到真核表达质粒pcDNA₃-neo内, 克隆出真核表达质粒pcDNA₃-hbFGF.结果：提取及纯化的pUC18-hbFGF质粒含有大小正确的hbFGF cDNA碱基片段，其碱基序列为编码目的基因的正确序列；凝胶电泳结果证明已将此片段正确地克隆到pcDNA₃-hbFGF内.结论：成功地构建了hbFGF基因的真核表达质粒pcDNA₃-hbFGF.

关键词：成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒

0引言

hbFGF具有广泛的生物学活性，其与组织修复和创面愈合密切相关的主要作用为促进修复细胞DNA合成、迁移、分化^［1～3］；调节细胞外基质蛋白合成^［4～5］；减轻缺血性损伤及保护重要组织功能^［6～7］ ；参与其它生长因子的生物学效应，发挥重要的调节功能等^［8，9］. 因此，构建hbFGF的cDNA真核表达质粒，无疑对hbFGF在组织修复过程中所发挥的分子调控机制及表现的生物学效应等基础理论的深入研究，以及包括基因治疗在内的hbFGF的临床应用提供重要的物质基础.

1材料和方法

1．1材料限制性内切酶：EcoRI,BamHI（Promega）；核酸修饰酶：T4 DNA连接酶, RNase A（Sigma）； PCR Markers（华美生物工程公司）；Wizard^TM Plus Milipre DNA纯化kit（Promega）. 细菌菌株JM109，全军基因诊断研究所提供，基因型：recAl supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiA(Lac-proAB)F′［traD36 proAB+ LacI8LacIAM15］. 质粒pUC18-hbFGF：R & D Systems，BBG22；含位于HindⅢ和EcoR1酶切位点间的490bp的hbFGF cDNA片段，应具有的hbFGF硷基序列(Fig 1). pcDNA₃-neo：基础部校生化教研室提供，含有启动子T7位于多克隆位点前，复制起始点SV40ori，抗氨苄青霉素及G418基因 (Fig 2).

图 1pUC18-hbFGF内应具有的hbFGF cDNA序列

Fig 1Nucleotide sequence of hbFGF cDNA in plasmid pUC18-hbFGF

图 2质粒pcDNA₃-neo图谱

fig 2Map of plasmid pcDNA₃-neo

1．2方法所用常规方法参照文献［10］，部分稍加改动.

1．2．1质粒的扩增及纯化 氯化钙法制备感受态菌MJ109;pUC18-hbFGF,pcDNA₃-neo，pcDNA₃-hbFGF质粒转化宿主菌、筛选阳性菌落、小量制备质粒DNA;酶切及琼脂糖凝胶电泳分析选出含相应质粒的阳性细菌克隆. 对含相应质粒的阳性细菌克隆扩大培养后，按Wizard^TM Plus Milipre DNA纯化kit 操作说明进行质粒DNA制备及纯化，于DU640型核酸/蛋白检测仪（Beckman）上测定A260 及A280值， 判断其纯度，并测定含量.

1．2．2限制性内切酶进行酶切及琼脂糖凝胶电泳分析应用适当的内切酶加入对应的质粒， 37℃温育酶切. 将酶切产物于琼脂糖凝胶上50 V电泳30 min，EB染色，紫外透射下观测分析.

1．2．3目的基因(hbFGF cDNA)的序列测定①提取及纯化后的质粒pUC18-hbFGF，调节核酸浓度0.2 g/L；②测序反应：4个0.5 mL的Eppendorf管中分别加入4种荧光标记引物ddNTP混合物(MixA 4 μL, MixC 4 μL, Mix G 8 μL, MixT 8 μL)，模板DNA 1 μL ,1 μL ,2 μL ,2 μL,加入20 μL石蜡油封. PCR反应：96℃，15 s；55℃，1 s；70℃，60 s；15个循环后改为95℃，15 s；70℃，60 s；15个循环. 反应产物用950 mL/L乙醇100 μL于室温下沉淀15 min，700 mL/L乙醇洗涤，沉淀用6 μL去离子甲酰胺-EDTAc 5 μL，50 mmol/L EDTA 1 μL（pH8.0)重溶. 90℃变性2 min，快速作经顶电泳的聚丙烯酰胺凝胶电泳，373A型DNA序列分析仪(PE)测定DNA序列.

1．2．4真核表达质粒构建的连接反应酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，将含有目的片段的凝胶条带切下，酚：氯仿抽提回收目的片段. 连接反应：pcDNA₃-neo fragment 1.0 μL(0.1 μg)，hbFGF cDNA fragment 5.0 μL(0.5 μg)，T4 ligase 1.0 μL，10×buffer 1.0 μL，10 mmol/L ATP 1.0 μL，H₂O 1.0 μL，置15℃反应16 h. pcDNA₃-hbFGF质粒构建过程见Fig 3.

1．2．5构建的pcDNA₃-hbFGF质粒再转化宿主菌、克隆筛选、质粒提取及酶切鉴定， 方法同前.

2结果

2．1pUC18-hbFGF酶切鉴定HindⅢ+EcoRⅠ双酶切pUC18-hbFGF经凝胶电泳后观查分析，与预计结果相符合，酶切后获取了分子大小约490 bp的插入pUC18内的片段，初步证明pUC18-hbFGF内具有正确的hbFGF cDNA片段（Fig 4）.

2．2pUC18-hbFGF序列测定 经对pUC18-hbFGF测序证实，pUC18-hbFGF内插入片段的碱基组成与R & D Systems公司提供的序列及公开发表的hbFGF cDNA序列完全一致（Fig 1，5）.

图 3真核表达载体pcDNA₃-hbFGF的构建过程示意图

fig 3Constructing process diagram of eukaryotic expression plasmid pcDNA₃-hbFGF

2．3构建的真核细胞表达质粒pcDNA₃-hbFGF的酶切鉴定将构建好的真核细胞表达质粒pcDNA₃-hbFGF经HindⅢ+EcoR1双酶切，凝胶电泳后的结果与预计的切取片段分子量相符合，切取一约大小490 bp的片段，证实已将目的基因hbFGF cDNA克隆到pcDNA₃-neo载体内，因此真核细胞表达质粒pcDNA₃-hbFGF构建成功（Fig 6）.

图 4pUC18-hbFGF酶切结果

fig 4Identification of hbFGF cDNA segment colonized in pUC18-hbFGF by agarose gel electrophoresis

a: pUC18-hbFGF digested with HindⅢ plus EcoRⅠ; b: pUC18-hbFGF; c: PCR markers.

图 5pUC18-hbFGF测序结果

fig 5Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of bhFGF in pUC18-hbFGF obtained by sequence analysis

图 6pcDNA₃-hbFGF酶切结果

Fig 6Identification of hbFGF cDNA segment colonized in pcDNA₃-hbFGF by agarose gel electrophoresis

a: pcDNA₃-neo; b: pcDNA₃-hbFGF digested with HindⅢ plus EcoRⅠ; c: PCR markers.

3讨论

自从人类发现第一个生长因子NGF后^［11］，多肽生长因子在创面愈合中的基础理论和临床应用研究，则成为现代组织修复领域最受注目的课题之一^［2,5,9］. 增殖与分化是愈合过程中所必须的最重要的细胞生物活动之一，增殖需经过细胞的有丝分裂实现，大多数生长因子则为创面细胞的有丝分裂原^［9］. 多肽生长因子的临床应用已取得一定的成绩. 如EGF, FGF, IGF, PDGF等，对烧伤、放射性溃疡、糖尿病溃疡等都有促进愈合的作用^［12,13］. 但在临床实践中，人们发现生长因子的应用存在一定的限制性. 其中关键性的问题有：①难以在创面应用局部保持有效的浓度；②应用生物提纯或基因工程重组的生长因子产品代价昂贵；③局部坏死组织常阻断所给生长因子达到其发挥作用的靶细胞；④需联合应用不同作用机制的生长因子，且联合作用需采取合理的给药时相，如以FGF为代表的所谓感受因子（competence factor）需优先且相对长时间作用于处于G0期和G1期的细胞，而以EGF为代表的所谓增进因子（progression factor）则需在感受因子作用后相对作用较短时间，两类因子在作用时相上相互配合方能有效的启动细胞通过分裂周期不同<