第四军医大学学报1999年第20卷第8期

张浩彭玮丹王成济陈南春

摘要目的： 构建人c-myc第三外显子及3非翻译区反义真核表达载体，用脂质体介导法转染入胶质瘤BT325细胞，以期降低其c-Myc表达水平.方法： 采用基因重组方法构建真核表达载体；用G418筛选抗性细胞克隆；用免疫细胞化学ABC法检测细胞蛋白质的表达；用MTT法测定顺铂作用下，未转染及转染组细胞的存活率.结果： c-myc反义真核表达载体在BT325细胞中稳定表达，转染细胞c-Myc表达水平显著降低；c-Myc表达减弱细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性.结论： 抑制c-myc DNA第三外显子及其3端非翻译区反义表达载体能够显著抑制c-myc基因的表达；c-Myc在化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程中有重要作用.

关键词:反义c-myc载体构建免疫细胞化学凋亡

0引言

c-myc为动物细胞中一种高度保守的癌基因，它编码的蛋白质为65 ku～68 ku的核内磷蛋白，该蛋白具有转录调节因子所需的所有结构，包括N末端反式激活区域^［1］,C末端基序及相互联结的螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链基序^［2］，它通过与MAX等转录因子二聚化^［3］，识别并结合特定基因转录调节序列，进而调节相应基因的表达^［4］. 近年来研究表明，c-Myc高表达与细胞的增埴^［5］、分化、凋亡^［6］、恶变及转化^［7,8］密切相关.

人脑胶质瘤是最常见的颅内脑瘤，约占所有颅内肿瘤的43.85%，惠宏襄等^［9］运用Southern blot和RNA打点杂交方法检测到人脑胶质瘤标本中c-myc扩增及重排现象. 为研究c-Myc蛋白在人脑胶质瘤BT325细胞增殖、凋亡中的作用及其作用的机理，我们采用分子克隆技术，构建了人c-myc第三外显子反义表达载体，而后用脂质体介导转染入BT325细胞中，用G418筛选出抗性细胞克隆，然后采用免疫细胞化学ABC法检测了抗性细胞克隆c-Myc的表达水平;用顺铂诱导BT325细胞凋亡， 后用MTT法检测c-Myc表达降低前后，BT325细胞对顺铂诱导凋亡敏感性的变化.

1材料和方法

1．1材料

1．1．1细胞系人胶质瘤BT325细胞系由本室保存.

1.1．2菌种和质粒E. coli JM109， pBluescript M13-， pcDNA3均为本室保存；pMYC质粒，载有1.39 kb的人c-myc基因第三外显子及3′端非翻译区片断,由柴玉波博士馈赠.

1．1．3工具酶及试剂限制性内切酶、无DNase的RNase和T4 DNA连结酶，购于华美生物工程公司；小鼠抗人c-Myc单克隆抗体及ABC免疫组化试剂盒购自北京中山生物工程公司；小牛血清为杭州四季青公司产品； AdvantageTM^TM PCR-Pure Kit为ClonTech公司产品； RPMI 1640, lipofectAMINE^TM及G418购自Gibco公司.

1．2方法

1.2.1质粒小量提取与大量制备按《分子克隆操作指南》中的碱裂解法进行.

1．2．2感受态细胞制备及细菌转化将E. coli JM109培养至对数生长期（A_{600 nm}=0.3～0.6）,离心,悬于1/10体积的TSB中,冰浴10 min,取100 μL加适量质粒DNA，冰浴15 min～20 min, 再加入37℃预热的TSBG，37℃ 1 h,涂布于含氨苄青霉素平板上, 37℃倒置培养20 h,挑取单个菌落鉴定.

1．2．3目的DNA的片段回收酶切产物经10 g/L琼脂糖电泳后，切下含目的片段的凝胶，用Advantage^TM PCR pure kit,按说明回收目的片段.

1.2.4pcDNA-3MYC载体的构建参照《分子克隆操作指南》. 原始质粒pMYC与载体pBluescriptM13-经EcoR I和HindⅢ双酶切后分别得到1.4 kb目的基因片断和2. 96 kb的载体片断，经T4 DNA连接酶作用后,得到重组质粒pBlue-MYC;该质粒与真核表达载体pcDNA3（含CMV启动子）经EcoR I和Xho I酶切，T4 DNA连接酶连接后得到质粒pcDNA3-MYC（由于目的基因片断的方向与CMV启动转录的方向相反，其转录产物为与mRNA互补的反义RNA）.

1．2．5细胞转染及细胞克隆的筛选用2.5 g/L胰蛋白酶消化处于对数生长期的BT325细胞，接种于50 mL培养瓶中,继续培养24 h,使85%以上细胞贴壁；转染前45 min,将4 μg DNA, 12 μL脂质体与适量无血清RPMI 1640混合成400 μL转染液；转染前15 min, 先用无血清RPMI 1640将待转染细胞洗两遍；向转染液中加入1.6 mL无血清RPMI 1640，混匀后加入前述洗过的细胞中，培养5 h，加入含20 mL/L小牛血清的RPMI 1640继续培养67 h, 用含600 g/L G418， 10 mL/L小牛血清的RPMI 1640筛选2 wk至抗性克隆形成,挑选细胞克隆扩大培养.

1．2．6细胞爬片的制备用2.5 g/L胰蛋白酶消化呈贴壁生长的BT325细胞，加入适量的含10 mL/L小牛血清的RPMI 1640制备细胞悬液,取一滴于盖玻片上，37℃培养60 min,加入含10 mL/L小牛血清的RPMI 1640继续培养60 h.

1.2.7免疫细胞化学ABC法检测转染的BT325细胞中c-Myc蛋白的表达细胞爬片用0.02 mol/L PBS洗3遍，1 mol/L Triton-x100处理15 min之后,置于冷丙酮中固定15 min,晾干,余下步骤按ABC免疫组化试剂盒说明进行.

1.2.8MTT法测定顺铂作用下BT325的存活率将细胞接种于96孔板,每孔接种1.5×10⁴细胞,加入200 μL培养液,待细胞贴壁后加不同浓度顺铂，每种浓度平行3孔，对照只加相应培养液；培养60 h后每孔加入新配制的MTT溶液（5 g/L），继续孵育4 h，吸弃培养液，每孔加150 μL DMSO, 剧烈振荡10 min, 选择490 nm波长,以空白培养液调零点，用DG3022型酶标仪测各孔吸光度值，记录结果，取同样浓度下3孔吸光度值的均数与3个未加药孔吸光度值均数的商作为细胞的存活率.

2结果

2．1原始质粒pMYC的酶切鉴定根据背景资料，原始质粒pMYC（Fig 1）经EcoR I和HindⅢ酶切后可得到长度为3.0 kb的p3zf(-)载体片段和1.4 kb的c-myc第三外显子及3'端非翻译区片段（Fig 3 Lane 1）, 酶切结果与之完全相符.

图1pMYC原始质粒图Fig 1Original pMYC plasmid map

2.2pBLUE-MYC的构建原始质粒pMYC和质粒pBluescriptM13-经EcoR I和HindⅢ充分酶切、琼脂糖凝胶电泳、AdvantageTM^TM PCR-Pure Kit回收，分别得到1.4 kb的目的基因片断和2.96 kb的载体片断,经连接、转化后，筛选出氨苄抗性克隆，然后挑取5个单克隆扩增培养、提取质粒，用EcoR I和HindⅢ酶切鉴定出含有1.4 kb片断和2.96 kb片断的重组质粒.

2.3pcDNA3-MYC的构建用EcoR I和Xho I双酶切pBLUE-MYC （3.36 kb）及pcDNA3 (5.4 kb) 质粒，按2.2步骤得到1.4 kb的目的基因片断和5.4 kb的载体片断, 经连接、转化,筛选出氨苄抗性克隆并鉴定出含有1.4 kb和5.4 kb片断的重组质粒. pcDNA3-MYC构建过程(Fig 2).

图2pcDNA3-MYC构建过程

fig 2Constructing of plasmid pcDNA3-MYC

图3pMYC原始质粒的鉴定及pcDNA3-MYC真核表达载体的构建Fig 3Identification of Original pMYC plasmid and construction of pcDNA3-MYC

eukaryotic expressing vector

1: pMYC/ EcoR I+ HindⅢ; 2： pBluescriptM13-/EcoR I+ HindⅢ; 3： pBLUE-MYC/ EcoR I+ HindⅢ; 4： λDNA/HindⅢ Marker; 5: pcDNA3/EcoR I+ Xho I; 6: pcDNA3-MYC/EcoR I+Xho I.

2.4pcDNA3-MYC质粒转染BT325细胞及其在细胞中的表达用12 μL脂质体分别介导4 μg pcDNA3-MYC和4 μg pcDNA3质粒转染BT325细胞， 600 g/L的G418筛选2 wk， 挑取筛选的细胞克隆稳定培养；用转染组和未转染组细胞分别制备细胞爬片，在染色之前，细胞爬片先用1 mol/L的Triton-x100处理15 min,然后在预冷的丙酮中固定15 min，晾干，余下步骤按照ABC Kit操作说明进行. Fig 4为阴性对照， Fig 5～7分别为未转染细胞、转染pcDNA3细胞、转染pcDNA3-MYC细胞的免疫组化染色结果. 从图中我们可以看出：c-Myc在未转染及转染pcDNA3细胞的胞核中表达量均比较高，而在转染pcDNA3-MYC细胞胞核中的表达则受到显著抑制，几乎见不到其表达，这说明我们构建的c-myc 反义真核表达载体在BT325细胞的表达能抑制c-Myc蛋白的表达.