生命科学1999年6月第11卷增刊

山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100胡晓燕曲音波

关键词：热休克蛋白

热休克蛋白（Hsps）是细胞在一些应激条件，如热休克、葡萄糖饥饿或受到病原菌感染时有高效表达的一族蛋白。Hsps有高度的保守性，在不同的菌株中同族的Hsps有很高的序列同源性，而不同族的Hsps之间却无明显的同源性，如Hsp60s和Hsp70s。热休克蛋白不仅在应激条件下有高效表达，而且在正常的生理条侏下，许多热休克蛋白也有组成型表达。它们参与一些重要的细胞生理活动，如蛋白质转位、拆叠和装配，因此又被称为“分子伴侣”。大多数热休克蛋白在正常和应激条件都具有识别非天然蛋白的能力，在受到热休克或暴露于其他形式的环境压力时，许多细胞内蛋白会发生部分或全部变性，此时Hsps可识别暴露于变性蛋白表面的疏水性区域，协助它们进行重新折叠，或者将无法恢复的蛋白质转移给蛋白质降解系统，使之降解，从而可避免细胞进一步受到伤害，因此Hsps对细胞具有保护作用。除此以外，在受到感染和发生自身免疫性疾病时，Hsps可作为一重要的抗原被免疫系统识别，因此其在医学方面的作用也日益受到重视。

1 热体克蛋白——蛋白质生物合成过程中的分子伴侣^[1]

在过去几年中，对热休克蛋白在细胞生理活动中的重要作用已有了更深入的了解。它们直接参与了从初生链合成到多亚基复合体装配的整个蛋白质生物合成的过程，因此，又被称为“分子伴侣”。目前分子伴侣是泛指参与介导多肽的正确折叠和装配的一类蛋白伴侣的功能主要有两方面，一方面阻断非生产性的蛋白之间的相互作用；另一方面则可把正在折叠的蛋白与其他的蛋白隔离开，使蛋白处于一有利于折叠的状态。因此它们对于生命来说是必需的。大多数分子伴侣是热休克蛋白，如Hsp70s、Hsp60s、Hsp90s、Hsp15-30s和Hsp100s。

其他的有伴侣功能的蛋白，如SecB和PapD,主要调节特定的蛋白质的折叠、定位和装配反应，所以最主要的还是热休克蛋白。

1.1 Hsp70s

Hsp70s在所有真核细胞的腔室中以及至今检测过的所有细菌中都存在，且高度保守。不同来源的Hsp70s有相似的生化特性，都具有高亲和力的ATP结合位点的肽结合位点，Hsp70s可识别非天然和未折叠的蛋白，但它们对处于折叠状态的蛋白却几乎无识别能力。这说明Hsp70s与蛋白的结合是依赖于对未折叠状态的识别，而不是对特定序列的识别。Flynn等证明8～25个残基的肽段可以结合到细胞质的Hsp70s族Hsc蛋白和内质网的BiP上，并可刺激它们的ATPase活性。Hsp70s与初生蛋白结合主要是为了防止在合成过程中蛋白质发生成熟前的错误折叠和凝聚，并且使新合成的肽链处于一松散构象状态，以利于进一步的折叠或移位过程的进行。

1.1.1 E.coli DnaK DnaK最初是作为λ噬菌体DNA在E.coli中复制所需的一种宿主基因的产物而为人们所认识的。它在正常的细胞生理活动中也有非常重要的作用。DnaK基因突变会导致 e.coli的温度敏感生长。 E.coli的合成会因胞内变性蛋白的积累而增加。1988年Clarke等发现DnaK可与在E.coli中表达的外源真核蛋白结合，Phillips等在1990年则发现DnaK的过量表达有助于lacZ杂合蛋白穿过细胞的内膜运往胞外。这些观察都表明DnaK在调节胞内蛋白与蛋白之间的相互作用方面有重要作用。在噬菌体复制时， dnaK与其他两种热休克蛋白DnaJ和GrpE协同作用，参与该过程，而且它还可与DnaJ共同作用活化与质粒P1复制有关的起始蛋白RepA。在这两个过程中DnaK的作用是依赖于ATP的，而且DnaJ和GrpE的存在对它的功能也是必需的。体外实验已证明，DnaK的活性在DnaJ和GrpE存在时可提高50倍。此外，DnaK可保护酶在体外时免受热失活。这种保护作用不需ATP；另一方面，DnaK也能通过溶解高温下形成的聚合体，使热失活的聚合酶重新恢复活性，这一过程则依赖于ATP水解反应。Pierpaoli^[2]等应用荧光光谱分析研究了E.coli中DnaK/DnaJ/GrpE系统与肽结合、释放的作用过程，基本过程如下：（1）ATP水解，并使DnaK构象发生改变，这种状态与GrpE和肽的结合能力比较弱，但与DnaJ却有很强的结合力；（2）DnaJ与DnaK结合后，可使DnaK的构象发生变化，从而有利于其与肽发生结合，这一反应虽然速度较慢，但DnaK与肽的亲和力却非常高；（3）在DnaJ的作用下，DnaK恢复成原来的构象状态；（4）肽从复合物上脱离。过去认为DnaK仅与一引起疏水性氨基酸如Ile、 leu、 Ala有作用，但是最近发现DnaK上也有亲水性氨基酸Lys和 arg的结合位点，而且当其疏水性氨基酸结合位点被占据以后，DnaK与Lys和Arg的结合能力会随之增强。

1.1.2 酵母中的HsP70s 酵母中有八种HsP70s，其中Ssclp位于线粒体基质中，Kar2p位于内质网腔中，其余六种位于胞质中。

1.1.2.1 Ssclp 它和E.coli中的DnaK最为接近，这与内共生假说一致。基因破坏实验说明Ssclp对所有生长条件下的细胞都是必需的。若Ssclp失活则会导致线粒体的蛋白质运输发生障碍，说明Ssclp在进入线粒体中的蛋白的膜转位和折叠过程中起重要作用。

1.1.2.2 Kar2p Kar2p参与蛋白进入内质网的转位作用，它与Ssclp功能相似，哺乳动物细胞中在内质网定位的HsP70s又称为BiP，它可与未装配的免疫球蛋白重链分子结合，而对免疫球蛋白无结合能力，说明BiP在蛋白质装配过程中有重要的作用。又因它也是一种葡萄糖调节蛋白，所以又被称为Grp78。它与酵母中的Kar2p一样，也可被各种应激条件所诱导，如葡萄糖限制，分泌前体的积累等，它们可使已合成的蛋白处于一松散状态直至其他亚基合成完毕才装配形成复合体，并且可把异常蛋白运输到内质网降解系统，使之降解，以免对细胞造成进一步的损害。

1.1.2.3 胞质中的HsP70s 它属于ssA和ssB两个亚族，其中ssA亚族包括四种蛋白，其表达受热休克诱导，而属于ssB亚族的两种蛋白却在热休克时关闭。ssA亚族对于酵母来说是必需的。体外实验证明，ssA亚族对蛋白进入内质网和线粒体的蛋白转位及发生正确折叠有重要的作用。添加ssA可使转位作用加强，推测它们可能是通过使未折叠前体处于一松散的有利于转位的状态而起作用。

1.1.3 哺乳动物胞质中的Hsp70s 在哺乳动物细胞中发现了一类广泛存在的热休克蛋白--Hsp110，它属于HsP70s的一个亚族。体外热变性实验和重新折叠分析表明，Hsp110在选择性地识别变性蛋白和使它们维持一可溶性的折叠感受态方面，比Hsp70更为有效。因而Hsp110是哺乳动物细胞内很重要的一种分子伴侣，它是细胞保护和修复变性蛋白的一个重要工具。

1.2 Hsp60s 又称为 Chaperones60(Cpn60)。所有的Hsp60s除了一级结构相似以外，它们的二级结构也都是由两个各含有七个亚基的环所组成。体外和体内实验都已证明，Hsp60s可与未折叠蛋白结合，并且可降低折叠时的能量障碍或降低中间物对凝聚的敏感性。除此以外，Hsp60s还协助某些蛋白，如细胞色素从基质到线粒体内膜空间的运输。

1.2.1 GroEL GroE蛋白是E.coli中主要的热休克蛋白之一，它包括65kDa的GroEL与15kDa groES两种蛋白质。其中GroEL与真核细胞中的 Hsp60s有很强的同源性，它与GroES共同协助蛋白质的折叠和装配过程。基因缺失实验表明^[3]groEL和groES对细胞在任何温度下的生长都是必需的。groEL或groES突变会降低DNA和RNA的合成速度，而且在非允许温度下细胞不能进行正常的分裂。GroE蛋白在E.coli的噬菌体形成过程中也有作用。GroEL和GroES的过量产生可通过促进突变蛋白的正确折叠或装配来抑制许多基因的温度敏感突变。

早期在E.coli中表达真核蛋白时，发现异源蛋白在E.coli中合成的量比较理想，但由于它们在细菌中易形成包含体，阻碍了它们进一步发生正确折叠，而使这些蛋白无法运输到胞外。为解决这一难题，过去常用尿素溶解这些包含体，然后再在体外还原，这样处理之后得到的蛋白量就很少了。实验发现，GroEL和GroES的过量表达可以防止包含体的形成因此将来GroE过量生产菌在提高细菌中外源蛋白的生产方面是很有前途的。

1.2.2 最近在不同的生物体的线粒体中都发现了Hsp60s，它们在热休条件下，可占到细胞总量的1%。酵母线粒体中的Hsp60s是由核MIF4基因编码的。该蛋白质的氨基端有一线粒体定向的序列。这段序列在其进入线粒体后即被切除。Hsp60s可以装配成由两个各带有7个亚基的圆环压缩而成的聚合体。这个过程可能由功能性的Hsp60s自身来完成。mif4基因的突变是一致死性突变，这种突变体可以进行蛋白质的运输，但在进入线粒体后，不能进行正确的折叠和装配。最近，在真核细胞的胞质中发现了一种TCP1复合物，实验证明它与在细菌、酵母和真核细胞器中发现的Hsp60s有较强的同源性。而且Liang^[4]等还发现胞质中的这种Hsp60s可参与细胞骨加架蛋白如微管蛋白、肌动蛋白的合成。并且TCP1复合物是一中心体组分，因而很明显参与了微管的核化过程。其他的分子伴侣，如Hsp60s、Hsp90s和smHsp在形成和保护细胞骨架方面也有非常重要的作用。

Hsp70s和Hsp60s都广泛存在于细菌和真核生物的线粒体和叶绿体中，但它们是相对独立的。在线粒体中，Hsp70s在蛋白转位之前与之结合，Hsp60s则在稍后的阶段加入。有趣的是，NMR研究发现与DnaK结合的肽段处于一伸展状态。而与GroEL结合的肽则处于一α螺旋状态。而且两种蛋白在蛋白质折叠过程中的作用也不相同。这种不同是由于它们寡聚体状态的不同造成的。