湖南医科大学学报1999年第24卷第1期

罗自强孙秀泓秦晓群张长青管茶香

提要采用离体培养的肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)观察内皮素-1(ET-1)对肺表面活性物质(PS)合成的影响。结果显示：10^-11～10^-8mol^.L^-1的ET-1可促进PS的合成，量-效关系显著。与肺组织块培养相比，促进ATⅡ细胞PS合成所需的ET-1浓度较大。ET-1的促PS合成效应可被ET_A受体拮抗剂BQ₁₂₃阻断，而不受ET_B受体拮抗剂BQ₇₈₈影响。ET-1作用16h对ATⅡ型细胞的增殖无显著影响。结果表明，ET-1既可通过ET_A受体直接促进ATⅡ细胞合成PS，又可通过其它肺细胞实现对ATⅡ细胞的间接调控。

关键词：内皮素-1肺泡Ⅱ型上皮细胞肺表面活性物质内皮素受体

肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)是合成分泌肺表面活性物质(PS)的主要部位。我室近期已报道ET-1可促进离体肺和培养的肺组织分泌、合成肺表面活性物质(PS)^［1，2］。由于肺组织的细胞组成复杂，对PS合成分泌的调控可能通过其它肺细胞来间接实现。因此，有必要从细胞水平来进一步证实ET-1对ATⅡ细胞的PS合成具有直接作用。

1材料与方法

1.1材料Wistar大鼠(本校实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重210±28g。ET-1，PMA，H₇，DMEM培养基、弹性蛋白酶、大鼠IgG(Sigma公司产品)，核糖核酸酶(华美公司产品)，³H-氯化胆碱(杜邦公司产品)。

1.2ATⅡ细胞的纯化^［3］氨基甲酸乙酯(1g^.kg^-1)腹腔注射麻醉大鼠，用生理盐水经肺动脉冲净肺血。进行支气管肺泡灌洗，洗出肺泡内细胞。将弹性蛋白酶(4U^.ml^-1)注入肺泡，37℃消化20min。肺剪碎成1mm³大小，加入小牛血清终止消化，旋涡振荡30s,80目和180目滤网依次过滤，1?500r^.min^-1离心10min收集细胞。台盼蓝排斥法测成活率。用DMEM(每ml含青霉素100U、链霉素100μg)配制5×10⁶个细胞^.ml^-1。将细胞悬液转移至已被大鼠IgG包被的培养皿，37℃，5% CO₂培养1h，使带有Fc受体的肺泡巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞贴壁。收集未贴壁的细胞，用改良巴氏染色法染色，光镜下ATⅡ细胞胞浆中有蓝色颗粒，计数500个细胞测细胞纯度为(80.5±5.1)%。纯化的ATⅡ细胞在电镜下可见板层体结构。调节细胞浓度为5×10^5.ml^-1，转移到96孔板。

1.3ATⅡ细胞的磷脂酰胆碱(PC)合成检测细胞培养8h后，各孔分别加入处理因素和³H-胆碱(0.1μCi^.ml^-1)再培养16h，弃上清，用Hank液洗3次，每孔加1% Triton 100μl裂解细胞，液体闪烁计数仪测定放射性强度。PC是PS的主要磷脂组分，通常以³H-胆碱掺入量反映PS的合成。

1.4肺组织块培养^［4］无菌摘取大鼠双肺，剪成1mm³小块。预冷DMEM洗3次，取20～30小块置于培养皿中，加入不含血清而含青霉素、链霉素的DMEM，置95% O₂，5% CO₂，37℃下培养8h，加入ET-1再培养16h。

1.5ATⅡ细胞的增殖检测在ATⅡ细胞培养液中分别加入10^-12和10^-10mol^.ml^-1的ET-1培养16h，加MTT 20μl(5mg^.ml^-1)培养4h后(MTT可被活细胞还原成深蓝色的Formazan)，加100μl含0.04N HCl的酸化异丙醇溶解Formazan颗粒。在酶标仪570nm处测定各孔光密度，反映活细胞数目^［5］。

1.6统计学分析实验数据以X±s表示，在IBM-PC微机以Instat软件采用方差分析比较各组间差异。

2结果

2.1ET-1促ATⅡ细胞PS合成以对照组³H-胆碱掺入量为100%，10^-12～10^-8mol^.L^-1 ET-1可使ATⅡ细胞的³H-胆碱掺入量依次增加，量-效关系显著(r=0.9867,P＜0.01)。但10^-12mol^.L^-1 ET-1组与对照组相比较差异无显著性(P＞0.05，图1)。

图1内皮素-1对肺泡Ⅱ型细胞肺表面活性物质合成的影响①P＜0.05与对照组比较；②P＜0.01与对照组比较

Fig.1The effects of ET-1 on pulmonary surfactant synthesis of alveolar type Ⅱ cells①P＜0.05 vs control;②P＜0.01 vs control

2.2ET-1促ATⅡ细胞和肺组织PS合成的比较10^-12mol^.L^-1 ET-1对ATⅡ细胞³H-胆碱掺入量无显著促进(P＞0.05)，对肺组织的³H-胆碱掺入量有明显促进作用(P＜0.01)，10^-11mol^.L^-1 ET-1能显著促进ATⅡ细胞(P＜0.05)和肺组织(P＜0.01)PS合成(图2)。

图2内皮素-1对肺泡Ⅱ型上皮细胞和肺组织表面活性物质合成的影响①P＜0.05，与对照组比较；②P＜0.01，与对照组比较

Fig.2Tahe effects of ET-1 on pulmonary surfactant synthesis of alveolar type Ⅱ cells and lung tissues①P＜0.05 vs control;②P＜0.01 vs control

2.3介导促ATⅡ细胞PS合成的ET受体ET_A受体拮抗剂BQ₁₂₃在10^-7和10^-6mol^.L^-1均可降低10^-10mol^.L^-1 ET-1的促PS合成效应，使ET-1组的³H-胆碱掺入量从为对照组的192.8±37.4%分别降至对照组的141.5±13.1%(P＜0.05)和108.6±20.1%(P＜0.01)。ET_B受体拮抗剂BQ₇₈₈在10^-7和10^-6mol^.L^-1时对ET-1的促PS合成效应均无显著影响(P＞0.05,图3)。

图3内皮素受体阻断剂对内皮素-1促肺泡Ⅱ型上皮细胞表面活性物质合成的影响(n=5)①P＜0.01，与对照组比较；②P＜0.05与10^-10mol^.L^-1 ET-1比较；③P＜0.01与10^-10mol^.L^-1 ET-1比较

Fig.3Effects of endothelin receptor inhibitor on pulmonary surfactant synthesis induced by endothelin-1 in alveolar type Ⅱ cells (n=5)①P＜0.01 vs control;②P＜0.05 vs 10^-10mol^.L^-1 ET-1; ③ P＜0.01 vs 10^-10mol^.L^-1 ET-1

2.4ET-1对ATⅡ型细胞增殖的影响浓度为10^-12和10^-10mol^.L^-1的ET-1对ATⅡ细胞的增殖均无显著影响(P＞0.05，图4)。

图4内皮素-1对肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖的影响(培养16h,n=6)

Fig.4Effects of endothelin-1 on the proliferation of cultured alveolar type Ⅱ cells (incubated 16h, n=6)

3讨论

肺组织的细胞种类达40余种，ATⅡ细胞占14%～16%^［3］。各类肺细胞通过旁分泌信号分子相互调控，共同维持肺内局部微环境稳态。我室以10^-12和10^-10mol^.L^-1的ET-1分别模拟正常血浆和组织中的ET-1水平，发现生理水平的ET-1可促进培养的肺组织块的³H-胆碱掺入，提高肺组织磷脂及PS特征性磷脂组分磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油的含量，促进肺的PS合成^［1，2］。本研究在离体培养的ATⅡ细胞上进一步证实，ET-1对ATⅡ细胞的PS合成有直接促进作用。但与保持着肺细胞间正常相互联系的肺组织块相比，肺组织块PS合成对ET-1的反应更敏感。这提示其它肺细胞的存在可提高ATⅡ细胞对ET-1的敏感性。因此，ET-1既可直接促进ATⅡ细胞合成PS，又可通过其它肺细胞实现对ATⅡ细胞的间接调控。

目前已在哺乳动物克隆到ET_A和ET_B两种ET受体，这两种受体在肺泡上皮细胞均有表达^［6］。本研究分别采用ET_A和ET_B受体选择性阻断剂BQ₁₂₃和BQ₇₈₈首次证实了参与介导ET-1促PS合成效应的是ET_A受体。ET-1具有较强的促丝裂作用，ET-1