第四军医大学学报1999年第20卷第2期

吕红兵金岩李鑫

摘要目的：检测正常胎鼠和腭裂胎鼠的腭突中骨形成蛋白5 mRNA表达的变化，探讨骨形成蛋白5(BMP5)在腭裂形成中的作用.方法：采用原位杂交技术观察在不同发育时期，正常胎鼠和腭裂胎鼠腭突中BMP5 mRNA的表达情况.结果：正常组和腭裂组比较结果表明，妊娠期第14日和第15日，正常组腭突的未分化间充质细胞和上皮细胞中BMP5 mRNA的表达呈强阳性，而腭裂组为弱阳性. 妊娠第16日，两组腭突中BMP5 mRNA的表达都较弱.结论：BMP5 mRNA在未分化间充质细胞中的弱表达与腭裂的形成密切相关.

关键词：骨形成蛋白腭裂组织化学原位杂交

0引言

各种化学药物，如地塞米松(Dexamethasone, DEX)、维甲酸(Retinoic acid, RA)等均可诱导小鼠形成腭裂，腭裂形成的主要原因是腭突上抬延迟，侧腭突中的间充质细胞增殖、分化能力减弱，成骨细胞数量减少，骨量形成不足，使得两侧侧腭突不能融合. 众所周知，骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein, BMP)可诱导未分化的间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞. BMP的这种诱导分化作用与腭裂的骨量形成不足之间的关系如何，目前研究甚少. 研究表明，BMP5与先天性骨骼发育畸形(如短耳小鼠)密切相关^［1～4］. 因此，我们着重研究了BMP5 mRNA表达上的变化与腭裂形成的关系.

1材料和方法

1.1标本制备前一日将8 wk～10 wk的BALB/c近交系小鼠，按3∶1的雌雄比例同笼，次日上午8∶00观察雌鼠的阴栓形成情况，有阴栓者为受孕鼠，并将该日定为妊娠日(Gestation day, GD) 0 d. 在GD12¹⁵(妊娠期第12天第15小时)，将14只孕鼠按1∶1的比例随机分为腭裂组和正常组，分别给药. 腭裂组：管饲维甲酸(100 mg/kg)(上海第六制药厂)，同时地塞米松(10 mg/kg，ip). 正常组：管饲无菌生理盐水(100 mg/kg), 同时无菌生理盐水(10 mg/kg，ip). 两组孕鼠分别于GD 14 d，GD 15 d，GD 16 d处死，取胎鼠头部，用40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，作冠状切片，厚度5 μm.

1.2探针制备及标记质粒pBmp5UT含有BMP5 5'非编码区的246个bp，由美国斯坦福大学发育生物学系Kingsley DM博士惠赠，质粒pBmp5UT转化XLI-Blue大肠杆菌，并进行酶切鉴定. 用碱裂解法提取质粒，纯化后用Not I和BamH I双酶切，12 g/L凝胶电泳后，回收所需的246个bp的片段，此特异性片段参照地高辛标记检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)说明书，采用随机引物方法标记.

1.3原位杂交方法步骤石蜡切片经常规脱蜡至DEPC水及0.1 mol/L PBS (pH 7.4)后，分别用0.2 mol/L HCl和蛋白酶k处理，梯度酒精脱水后室温干燥. 42 ℃杂交20 h后，分别用2×SSC，1×SSC，buffer Ⅰ，buffer Ⅱ依次充分洗涤. 正常羊血清封闭30 min后，滴加抗标记碱性磷酸酶地高辛抗体2 h (37 ℃),经buffer Ⅰ，buffer Ⅲ洗涤后用显色液(buffer Ⅲ 1 000 μL、左旋米唑0.24 mg，NBT 4.5 μL及BCIP 3.5 μL)暗处显色2 h，TE液中止反应，常规脱水透明封片.

实验对照为除去探针的空白对照及RNase消化对照，阳性对照为已反复证明为有阳性反应的骨肉瘤标本.

2结果

对腭部发育的组织形态学观察结果显示， 腭裂组GD 13 d, GD 14 d与正常组相比无明显变化，腭突的生长方式都是垂直向下生长，GD 15 d，正常组腭突开始上抬，而腭裂组的腭突单侧或双侧上抬延迟. 在GD 16 d，正常组的腭突已完全融合，腭裂组由于腭突上抬延迟，两侧腭突不能完全融合.

BMP5 mRNA阳性反应部位主要位于胞浆，为紫蓝色细颗粒状. GD 14 d至16 d，腭突主要由位于表层的上皮细胞和上皮层下的未分化外胚间充质细胞构成. 原位杂交观察结果显示，GD 14 d和GD 15 d，正常组腭突的大部分间充质细胞中BMP5 mRNA的表达呈强阳性，上皮中也有一些散在的阳性细胞，其分布的区域主要位于口腔侧的上皮细胞中(Fig 1). GD 14 d和GD 15 d，腭裂组中间充质细胞胞浆中BMP5 mRNA着色较弱，与正常组相比，其阳性着色明显减弱，阳性细胞的数目减少，分布也比较分散(Fig 2). 另外，上皮细胞中未见阳性信号. GD 16 d，腭裂组BMP5 mRNA的表达量和表达部位与GD 14 d,GD 15 d基本一致(Fig 3)，而正常组中BMP5 mRNA的表达量锐减，此时正常组和腭裂组中BMP5 mRNA的着色情况相似，都为弱阳性(Fig 4). 上皮细胞在此期未见表达.

3讨论

BMP5与骨骼发育畸形之间的关系是近几年才逐渐认识的. 短耳小鼠是一种先天性骨骼发育畸形的小鼠，这种畸形是由短耳基因(se)发生突变引起的. 直到1992年，Kingsley等^［5］通过染色体步移和外显子捕获技术得知这种突变的基因其实就是BMP5基因. 研究表明^［2］，BMP5开放读框中第616位的碱基c突变为t，使密码子cga突变为终止码tga，下游的蛋白无法表达，造成突变，引起短耳小鼠的骨骼畸形. 此外，用化学物质ENU作诱导剂，在正常的孕鼠妊娠期给药，也可使出生后的小鼠发生多种骨骼畸形，这种畸形也是由于BMP5多种形式的突变造成的^［2，3］. 所以，BMP5与骨骼发育畸形密切相关.

在骨骼的发育过程中，起初是未分化间充质细胞聚集、增殖，形成高密度的细胞区，形成未来骨骼的轮廓，称之为细胞凝聚区. 以后随着细胞的分化，未分化的间充质细胞分化为成骨细胞和软骨细胞. Jennifer等^［2］研究表明，在骨骼凝聚区出现之前，未分化的间充质细胞中就已经有BMP5的转录，其表达的范围与日后凝聚区形成的范围一致. 说明BMP5在促进间充质细胞凝聚的过程中有重要的诱导作用.

腭部的发育可分为4个时期：①腭突形态发生期；②腭突垂直向下生长期；③腭突上抬期；④腭突水平生长融合期. 由观察结果可以知道，其发育的时期主要在妊娠第14，15，16日. 本实验研究表明，GD 14和GD 15 d，腭裂组和正常组间充质细胞中BMP5 mRNA的表达量相差很大，正常组腭突的间充质细胞中BMP5 mRNA的表达呈强阳性，而腭裂组中却几乎为阴性. 因此，我们推测，BMP5 mRNA在正常发育中的强阳性表达可使间充质细胞继续向凝聚、增殖的方向发展，以便形成骨骼凝聚区. 异常发育的腭突间充质细胞中BMP5的弱表达使间充质细胞凝聚、增殖的速度减慢，最后可引起两方面的结果：一方面，由于凝聚区形成较小，使得以后的骨量形成不足. 另一方面，腭突不能达到正常的体积，使GD 16 d两侧腭突不能融合. GD 16 d，正常组腭突融合，腭裂组腭突不能融合，此期BMP5 mRNA的表达呈弱阳性. 表明当腭突融合后，BMP5在间充质细胞的作用大大降低. 另外，BMP5也是一种信号分子，在上皮-间充质中传递信号，已有文献报道，BMP5在听觉系统、神经系统的发育中，调控Bfi, MSXs等基因的表达，促进细胞的凋亡^［4，6］. 在本实验中，腭裂组中的上皮细胞中不表达BMP5 mRNA，正常组的上皮细胞中有散在的阳性细胞，因此推侧腭裂的形成与BMP5的这种信号传递作用可能也有关系.

综上所述，BMP5对腭突起作用的时间主要发生在GD 14 d和GD 15 d，在此期间，BMP5 mRNA的表达显著下降，影响了腭突的正常发育. 如能进一步研究BMP5基因突变与腭裂形成的关系，对于研究腭裂的发生机理将十分有益.

图1正常组GD 15 d

Fig 1Control group, on GD 15 d

Mesenchymal cells show strong positive staining, ISH×20

图2腭裂组GD 15 d

Fig 2Test group, on GD 15 d

Mesenchymal cells show weakly staining, ISH×200

图3腭裂组GD 16 d

Fig 3Test group, on GD 16 d

Mesenchymal cells are still weakly stained, ISH×200

图4正常组GD 16 d

Fig 4Control group, on GD 16 d

Mesenchymal cells are weakly stained, ISH×200

基金项目：校级科研资金资助97X144

作者简介：吕红兵，男，1973-09-11生，山西省永济市人，汉族. 1996年第四军医大学毕业，硕士研究生，已发表综述1篇. 电话：(029)3375369

作者单位：吕红兵金岩李鑫第四军医大学秦都口腔医学院病理科，陕西 西安 710033

参考文献

1.Kingsley DM.What do