中国医学科学院学报1999年第21卷第1期

李勇王忠彪^*康静¹陈常庆²戴瑞鸿范维琥

摘要目的制备高滴度供转导血小板衍生生长因子A链(PDGF-A)基因的重组逆转录病毒，为体内、外深入研究该基因表达产物自分泌和旁分泌的生物学功能奠定基础。方法将人PDGF-AcDNA片段插入含巨细胞病毒(CMV)启动子序列的逆转录病毒GINa载体的多克隆位点中，将构建的重组质粒导入病毒包装细胞PA317中，经G418筛选并扩增，以病毒液感染NIH3T3细胞，测病毒滴度，选择出抗性克隆，进行免疫组织化学检测，表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析和³H-TdR掺入法测生物学活性。结果病毒滴度最高为1.4×10⁵CFU/ml；免疫荧光染色法和SDS-PAGE电泳、Western blot证实PDGF-AA的表达；抗性细胞条件培养基的细胞活性高达51.2U/(10^6.d)。结论供转导PDGF-A基因的高滴度逆转录病毒得以制备，该基因获得有效表达，表达产物具有明显的致丝裂活性。

关键词：逆转录病毒血小板衍生生长因子基因表达

血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是以由二硫键相连、反向平行的两条肽链(A和B链)构成，有三种二聚体形式(PDGF-AA，-BB，-AB)。PDGF具有多种生物学功能，目前认为它在损伤修复、胚胎发育中具有重要作用，并可能参与了动脉粥样硬化、血管再狭窄、某些恶性肿瘤的发生。制备供转导并有效表达PDGF-A和B链基因的重组逆转录病毒对深入研究特定组织细胞中该基因表达产物的生物学功能极具价值。

1材料和方法

材料本实验所用的PDGF-AcDNA由美国哈佛医学院Collins等构建并提供，长约1.8kb，以EcoRⅠ插入质粒pUC19。逆转录病毒载体GINaCⅨ由复旦大学卢大儒先生构建并惠赠，其以GINa载体(5.5kb)为骨架，在多克隆位点中插入了人凝血Ⅸ因子cDNA(1.7kb)，在Neo^r基因和多克隆位点间插入了hCMV启动子序列(0.6kb)^［1］。E.coli J M103、DH5α菌株用于扩增质粒。限制性内切酶、T₄DNA连接酶、Taq聚合酶等购自promega公司；PA317细胞由中国科学院上海生物化学研究所刘新垣先生提供，NIH3T3细胞、neo基因的引物购于且合成于中国科学院上海细胞生物学研究所。G418等为GIBCOBRL公司产品；重组人PDGF-AA标准品、兔抗PDGF-AA抗体为英国PeproTech公司产品，羊抗兔荧光抗体、蛋白分子量由华美生物工程公司提供。³H-TdR购自上海原子核研究所。基因组DNA抽提试剂DNAzol购于Life Technologies公司。

方法

重组逆转录病毒载体的构建和鉴定：质粒转化、扩增、抽提、酶切、片段回收、连接反应均按标准方法^［2］进行。简而言之，用限制性内切酶BamHⅠ和H indⅢ分别酶切供体质粒pUC19PDGF-A和逆转录病毒表达载体GINaCⅨ，回收含PDGF-AcDNA片段和含CMV启动子顺序的GINa载体片段，纯化后连接，用酶切鉴定，将构建成的重组质粒命名为GINaCPDGF-A。

PA317细胞的转染和筛选：用磷酸钙介导转染法^［2］以纯化的质粒GINaCPDGF-A转化PA317细胞，用含G418(500μg/ml)的培养基筛选至抗性克隆形成，将边界清晰的8个克隆转移、扩增培养供病毒滴度测定和感染用。

滴度测定：取扩增的克隆细胞的上清病毒滴度，过0.22nm滤膜，感染对数期生长的NIH3T3细胞，再经抗性筛选近两周，以甲醇固定，再用Giemsa染色，计算集落数。最后根据稀释倍数及病毒悬液用量计算滴度，以克隆形成单位/每毫升(CFU/ml)表示。

逆转录病毒介导基因转移和整合的检测：根据逆转录病毒载体中Neo^r基因结构及PC/GENE程序，设计了一对用于扩增Neo^r基因的引物；5′-CGTTGTCGATGAAGCGGGAA-

gG-3′(+链，396～417)，5′-CCATGATATTCGGCAAGCAGGC-3′(-链，721～742)。参照DNAzol试剂盒方案抽提感染后的单克隆NIH3T3细胞基因组DNA，以之为模板，进行PCR扩增，同时以质粒GINaCPDGF-ADNA的PCR产物为对照。

免疫荧光细胞化学染色：感染后的NIH3T3细胞传入自制的载玻片上培养，细胞长至融合时，进行免疫荧光细胞化学染色，对照细胞以GINa转化。荧光显微镜下观察并拍照。

待测表达产物的准备：将抗性NIH3T3细胞传入培养瓶，在G418选择压力下扩增培养至亚融合时，弃原培养液，Hanks液洗3次，改用无血清培养基再培养24h，收集条件培养基，待测。

表达产物的检测与分析：待测表达产物进行还原性12%SDS-PAGE电泳和Western blot分析^［2］。

生物学活性测定：参照文献［3］，将NIH3T3细胞以含10%小牛血清DMEM调成细胞悬液，按1×10⁵/ml传入96孔板，培养6天，使细胞达静止。直接加入待测样品，继续孵育16h，加入7.4kBq³H-TdR，孵育5h，然后用10%TCA固定，0.25mol/LNaOH溶解，进行液闪计数。以引起最大刺激反应一半的量定义为1个活性单位(每组3个复孔)。

2结果

重组质粒的限制性内切酶片段分析重组质粒GINaCPDGF-A的构建方案如图1所示。质粒pUC19PDGF-A经BamHⅠ和HindⅢ酶切，电泳显示2.7kb和1.4kb片段；逆转录病毒载体GINaCⅨ也相应酶切得到6.1kb(含hCMV启动子序列的GINa载体片段)和1.7kb片段(人凝血Ⅸ因子cDNA片段；重组质粒GINaCPDGF-A分别用BgⅡ酶切和BamHⅠ、HindⅢ双酶切，前者显示7.5kb片段，后者显示6.1kb和1.4kb两条带。用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果见图2，表明由hCMV启动子驱动PDGF-A基因表达的载体得以成功构建。

图1重组质粒GINaCPDGF-A构建图

Fig 1The procedure of constructio n of recombinant plasmid GINaCPDGF-A

图2重组质粒GINaCPDGF-A的酶切鉴定

Fig 2Restriction analysis of recomb inant GINaCPDGF-A

1.pUC19PDGF-A/BamHⅠ+HindⅢ；

2.GINaCPDGF-A/Bgl Ⅰ；

3.GINaCPDGF-A/BamHⅠ+HindⅢ；

4.GINaCⅨ／BamHⅠ+HindⅢ；

5.lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢ markers

病毒滴度测定结果将8个抗性PA317克隆细胞株扩增后上清感染NIH3T3细胞，加G418选择压力，发现各株病毒滴度范围为＜(10～1.4)×10⁵CFU/ml，克隆1～8的滴度依次为2.6×10⁴、2.2×10⁴、＜10、1.4×10⁵、3.4×10²、2.8×10³、1.2×10⁵、3.2×10⁴CFU/ml，对照为＜10CFU/ml。表明病毒虽已整合入靶细胞，但整合、复制、成熟、装配和释放过程不同，从而使滴度呈现不同结果。

逆转录病毒介导基因的转移和整合PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示经感染的单克隆细胞基因组DNA和质粒GINaCPDGF-ADNA中均扩增出符合预期大小(371bp)的标志基因Neo^r片段(图3)，表明逆转录病毒介导外源基因转移并稳定转化至被感染的NIH3T3细胞基因组中。

图3重组GINaCPDGF-A介导的基因转移至NIH3T3细胞的PCR分析

Fig 3PCR analysis of recombinant retroviral vector-mediate transfer to NIH3T3 cells

1.PBR322/Msp Ⅰ markers;

2.plasmid GINaCPDGF-A；

3.transformed NIH3T3 cellular genomic DNA

免疫荧光细胞化学染色结果重组病毒感染的NIH3T3细胞免疫荧光细胞化学染色呈阳性结果(图4)；而对照细胞为阴性(未显示)。

图4重组病毒感染的NIH3T3细胞免疫荧光染色结果

Fig 4Immunofluohistochemistry sta in for PDGF-AA antigen of recombinant virus-infected NIH3T3 cells

表达产物的检测与分析结果还原性SDS-PAGE电泳结果显示相对分子量约16 000和21000处各有一条带；Western blot分析结果相对分子量约37000的单一 印迹(图5、6)。

图5GINaCPDGF-A转化的NIH3T3细胞表达