第四军医大学学报1999年第20卷第8期

边杰芳张柏根陈诗书钱虎声

摘要目的： 利用反义寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞（VSMC）c-myc， PCNA基因表达，为移植血管再狭窄的基因治疗提供理论依据.方法： 人工合成正义、反义及错配反义c-myc， PCNA基因片断，并转入体外培养的VSMC中，运用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）测定细胞中相应基因表达的情况.结果： 反义寡核苷酸能有效抑制VSMC中c-myc， PCNA基因的表达，而正义和错配反义寡核苷酸没有此效应.结论： 反义寡核苷酸能阻遏VSMC中相应基因的表达.

关键词：反义寡核苷酸血管平滑肌基因表达原癌基因

0引言

移植血管再狭窄的发生有多种因素，机制较复杂，其中，血管平滑肌细胞（VSMC）增殖是主要因素之一. 阻遏VSMC增殖，对移植血管再狭窄的发生可能有一定防治效果^［1］. c-myc和PCNA （proliferating cell nuclear antigen）基因在细胞增殖过程中起着重要调控作用. 我们运用反义寡核苷酸，阻遏c-myc和PCNA基因表达，减少VSMC增殖的观察结果，旨在为防治移植血管再狭窄和基因治疗提供理论依据.

1材料和方法

1.1主要试剂新生小牛血清（NBS）购自杭州四季青生物制品工程公司； DMEM， TRI_ZOL， 逆转录酶， Taq DNA聚合酶和100 bp DNA Ladder均购自Gibco-BRL公司；RNA抑制剂购自Boehringer Mann-heim公司；其它试剂购自华美生物工程公司或为国产分析纯.

1.2细胞培养取Wistar大鼠胸主动脉，以贴片法建立稳定的VSMC培养体系，经α-actin FITC鉴定证实. 用DMEM培养液（含200 mL/L NBS, 100 000 u/L青霉素, 100 mg/L链霉素），在37℃, 50 mL/L CO₂培养箱内培养.

1.3寡核苷酸的设计、合成根据GenBANK中大鼠c-myc， PCNA基因序列，选择其mRNA翻译起始位点，设计出相应的正义、反义及四个碱基错配反义的寡核苷酸序列. c-myc基因： 正义5′ATGCCCCTCAACG*T*C*3′， 反义5′CACGTTGAGGGGC*A*T*3′， 错配5′CACGTGGATTGGC*A*G*3′； PCNA基因： 正义5′TTTGAGGCACGCCTGA*T*C*3′， 反义5′GATCAGGCGTGCCTCA*A*A*3′， 错配5′GATTAGTCGTACCTAA*A*A*3′(“*”为硫代磷酸修饰的碱基； “_”为与反义寡核苷酸错配的碱基）.

3末端3个碱基被修饰的目的是为增加寡核苷酸在血清中的稳定性，防止其迅速被降解. 所有序列均由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化.

1.4细胞处理及寡核苷酸导入取直径为35 mm的六孔板，分别以1×10⁵ VSMC悬于1 mL 200 mL/L NBS-DMEM培养液中转种， 37℃, 50 mL/L CO₂培养箱内培养24 h，使细胞贴壁并生长达50％～60％融合. 换用5 mL/L NBS-DMEM血清饥饿培养48 h，使细胞生长同步化；在血清饥饿培养24 h后，每孔分别加入一种寡核苷酸（空白对照不加任何处理），浓度为10 μmol/L，并重复1次. 血清饥饿培养结束后，改用200 mL/L NBS-DMEM培养24 h，刺激细胞增殖生长.

1.5逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

1.5.1细胞总RNA提取及cDNA合成取经上述处理的细胞，弃培养液，PBS洗涤2次，每孔加入TRI_ZOL 1 mL，常规抽提细胞总RNA，取5 μg细胞总RNA加入至20 μL逆转录反应体系中，混匀后置37℃水浴60 min，合成cDNA.

1.5.2引物设计、合成根据PCR扩增引物设计原则，经计算机辅助分析，设计出c-myc和PCNA基因引物各一对. c-myc基因引物为： 5′-TGCTGCATGAAGAGACACCG-3′，5′-TTTCAACTGTTC-TCGCCGTT-3′， 形成569 bp的产物；PCNA基因引物为： 5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′， 5′-TCACCACAGCATCTCCAATAT-3′， 形成307 bp的产物. 内参照分别选用合成310 bp和540 bp产物的β-actin引物. 所有引物均由上海生工生物工程公司合成，PAGE纯化.

1.5.3PCR扩增逆转录产物98℃变性5 min，加入Taq DNA聚合酶2.5 U和液体石蜡油，94℃变性45 s， 60℃退火45 s， 72℃延伸1.5 min，共25个循环，末次循环72℃延伸10 min. PCR产物进行琼脂糖电泳分析.

2结果

2.1细胞总RNA提取及PCR产物鉴定将提取的RNA作紫外分光光度计测定，结果A_{260 nm}/A_{280 nm}≥1.9，得率较高，达到进一步实验的要求. 取未加处理的空白对照组PCR产物，经100 bp DNA Ladder鉴定，其长度与设计标准相符（Fig 1），说明PCR实验条件适当，PCR产物是相关基因表达的产物.

图1c-myc， PCNA基因的鉴定

Fig 1Identification of c-myc and PCNA gene

Lane 1: 100 bp DNA marker； Lane 2，3，4: c-myc； Lane 5，6，8: PCNA.

2.2基因表达PCR产物电泳显示：转入反义寡核苷酸的VSMC，其相关c-myc, PCNA基因的表达均有明显减弱，而转入正义、错配反义寡核苷酸的VSMC，则无此改变（Fig 2, 3）.

图2c-myc基因的表达Fig 2Expression of c-myc

Lane 1: 100 bp DNA marker； Lane 2: Starve； Lane 3: Sense oligonucleotide； Lane 4: Mismatch oligonucleotide； Lane 5: Antisense oligonucleotide.

图3PCNA基因的表达

Fig 3Expression of PCNA gene

Lane 1: 100 bp DNA marker； Lane 2: Starve； Lane 3: Sense； Lane 4: Mismatch； Lane 5: Antisense.

3讨论

反义技术是一项新兴的技术，它是通过碱基互补来封闭某些基因表达的一种基因治疗方法. 其特点是原理简单，专一性很强，这归因于反义核酸与靶RNA结合时碱基配对的高度专一性^［2］. 只要知道靶基因的序列，就可设计出相应的反义核酸，达到封闭靶基因表达的目的. 因此，它是一种前景十分广阔的研究和治疗手段. 在血管再狭窄形成机制中，VSMC增殖是关键环节之一，而导致VSMC增殖的因素主要有3方面： ①生长因子和细胞因子的作用增强；②VSMC原癌基因的高效表达；③细胞增殖周期蛋白的正调控. 我们在生长因子作用方面曾作过一些研究，取得了一定结果^［3～5］. 细胞增殖受体内外各种因素影响. 当VSMC受外界因素刺激后，细胞内部通过一系列信号肽转导系统作用，启动细胞内调节细胞增殖的基因表达，最终导致细胞增殖. 其中，细胞原癌基因和细胞周期调节基因在启动或维持细胞增殖过程中起着重要作用，通过测定这些基因的表达，可反映细胞增殖状态. 本研究利用针对c-myc, PCNA mRNA的3种不同寡核苷酸，比较了它们对VSMC中该类基因表达的影响.

c-myc原癌基因与禽成髓细胞病毒MC29转化基因同源，它编码一种短暂的、与核磷蛋白结合的特异DNA序列来调节DNA转录. 生长静止期的VSMC在受到有丝分裂源刺激后2 h～4 h内迅速诱导c-myc表达至高峰期，随后，细胞内的c-myc基因表达几个细胞循环. 因此，c-myc起着启动和维持细胞增殖的双重作用^［6］. PCNA最初是作为一种核抗原加以描述的，随后证实它是DNA多聚酶δ的一个辅助亚单位，这种细胞循环特异蛋白在细胞分裂时协助DNA引导链和随从链的合成，阻遏PCNA基因的表达，可抑制VSMC增殖与移行，但不会导致细胞死亡^［7］；PCNA在细胞循环进入S期时表达，而处在G₀/G₁期的细胞则基本不表达^［8］，因此，有人将其作为一种细胞增殖的标志^［9］.

本实验在生长因子研究基础上进一步对原癌基因和细胞增殖周期蛋白进行研究，并选择c-myc, PCNA基因作为对象. 结果表明，反义c-myc, PCNA基因片断能有效抑制其相应靶基因的表达，为反义技术治疗血管再狭窄提供经验和理论依据.

通过对细胞内相关基因mRNA表达水平的检测，能了解该基因在细胞功能活动中作用是否活跃. RT-PCR是对细胞内某一特定基因序列进行大量扩增后，检测该基因mRNA在细胞中的表达水平，在实验条件控制一致时，可半定量对比细胞内mRNA含量的多寡，从而判断细胞基因的表达水平^［10］. 实验结果表明，细胞增殖不活跃时（血清饥饿培养时），其c-myc和PCNA基因表达微弱，而细胞增殖时，该基因明显表达，且在刺激细胞增殖后短期就表达. 我们通过加入针对c-myc和PCNA基因的不同寡核苷酸，观察到经反义寡核苷酸处理的VSMCs，其相关基因表达减弱，而正义和错配反义寡核苷酸处理后，与对照组相比，变化不明显. 提示反义寡核苷酸进入细胞后通过碱基互补与靶mRNA结合，形成DNA：RNA杂交体，从而启动细胞内RNA酶（如RNase H等），迅速<