第四军医大学学报1999年第20卷第2期

郑强范清宇

摘要目的：研究白细胞介素-2基因转染人骨肉瘤细胞体外生物学特性.方法：应用逆转录病毒载体pDOR-neo将人的IL-2 cDNA插入人骨肉瘤细胞，经G418筛选及PCR分析获得阳性细胞，并测定其上清液中IL-2含量.结果：PCR可从阳性细胞基因组中扩增出IL-2基因片段，并从其上清液中测得每24 h 10⁵细胞IL-2 活性为50 U～800 U.结论：逆转录病毒介导的IL-2 cDNA可以在人骨肉瘤细胞系中获得有效表达，且转基因后的细胞较原野生型细胞体外生物学特性有明显差别.

关键词：白细胞介素-2逆转录病毒基因治疗

0引言

基因治疗是指应用基因工程技术，将外源性基因导入体内，并表达产物，从基因水平上治疗疾病. 目前研究较多为细胞因子基因修饰肿瘤细胞，注入体内，使肿瘤局部细胞因子浓度增高，有效地激发和加强局部及全身的免疫功能，避免因外源输入大量细胞因子而带来的一系列毒副作用. IL-2动物实验及临床应用均证明其可产生抗瘤作用^［1～3］，但其全身大剂量、长时间应用可产生严重的毒副作用，为了使IL-2能于肿瘤局部分泌，我室尝试用IL-2进行骨肉瘤基因治疗的实验研究. 为了研究肿瘤靶向的IL-2基因治疗，我们将IL-2基因转染人骨肉瘤细胞，观察了其体外生物学特性，为深入开展此方面研究创造条件.

1材料和方法

1.1主要试剂逆转录病毒载体pDOR-IL-2由我室制备^［4］；人骨肉瘤细胞系Ma和IL-2依赖细胞系CTLL，由第四军医大学免疫教研室惠赠；G418和Lipfectin均购自GIBCO公司；蛋白酶k，IL-2标准品均购自Promega公司.

1.2基因转染和筛选人骨肉瘤细胞系Ma在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中常规培养， 细胞生长至对数期时更换新鲜培养基，12 h后以1×10⁵～2×10⁵/mL接种于6孔板，培养24 h. 将2 μg pDOR-IL-2，10 μL脂质体（lipofectin）分别溶于100 μL无血清培养基，两溶液缓慢混匀，室温放置15 min，加入1.8 mL无血清培养基，混匀后加入上述培养细胞内，常规培养6 h后更换为4 mL含200 mL/L血清培养基，继续培养48 h后，用胰酶消化后以1∶5接种于含600 mg/L G418的培养基内，阳性者为Ma/IL-2细胞，同法转染空载体pDOR-neo.

1.3细胞体外扩增情况的观察将Ma，Ma/IL-2细胞均调至深度为5×10⁴/孔接种于24孔培养板中，隔天取3孔，2 g/L台盼蓝染色，计数取均值，绘制生长曲线.

1.4阳性细胞内IL-2 cDNA检测分别收集Ma细胞，转染空载体的Ma细胞以及Ma／IL-2细胞，按参考文献［5］分别提取3种细胞的DNA，各取DNA约0.1 μg，IL-2 cDNA上、下游引物各50 pmol，94 ℃×1 min，55 ℃×1 min，72 ℃×2 min，共30循环，72 ℃延伸5 min，电泳鉴定.

1.5IL-2活性测定用IL-2依赖细胞株CTLL，MTT法测定IL-2的生物学活性^［6］.

2结果

2.1基因转染细胞及其筛选情况经600 mg/L G418选择3 d后，培养细胞中开始出现大量死亡细胞（Fig 1），7 d存活细胞基本稳定，为表达neo基因的转染细胞，在G418存在环境中继续生长， 逐渐增殖形成典型“细胞岛”（Fig 2）. 对照Ma细胞经400 mg/L G418选择培养4 d全部死亡.

图1G418选择培养3 d大量细胞核固缩悬浮死亡

Fig 1A lot of dying cells after 3 d G418 resistant selection

图2转基因后G418培养7 d阳性细胞增殖形成“细胞岛”

Fig 2“cell island”after 7 d G418 resistant selection

2.2细胞体外扩增情况及形态观察转基因培养后，细胞由原棱形，逐渐变圆形或多边形状，与未转细胞相比体积稍增大，细胞增长率减慢，生长受抑制（Fig 3）.

图3细胞的生长曲线比较

fig 3 Curve comparison of cell growth

2.3外源基因检测分别用IL-2 cDNA引物扩增Ma，Ma/IL-2和Ma/pDOR细胞DNA及pHIG53 pDOR-IL-2载体质粒（包含有IL-2 cDNA）我们发现仅Ma/IL-2，pHIG53质粒及pDOR-IL-2载体扩出阳性带，其余两株细胞均未扩出（Fig 4）.

图4G418抗性细胞基因组DNA中目的基因的PCR鉴定

Fig 4The PCR amplification of IL-2 gene in genomic DNA of G418-resistant cells

1: Ma；2:pHIG53；3:pDOR-IL-2；4:PCR标准:1 000，750，500，300，150和50；5:Ma/IL-2; 6:Ma/pDOR.

2.4IL-2活性测定转基因后2 wk间隔1 d测定Ma／IL-2细胞培养上清中IL-2活性，每24 h 10⁵细胞分泌IL-2为50 U～800 U，而Ma细胞及转染载体的Ma细胞培养上清均测不到IL-2活性.

3讨论

肿瘤细胞的细胞因子基因疗法是目前肿瘤基因治疗中研究最多的方法. 人们已将多种细胞因子如IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，TNF，IFN-γ，GM-CSF等的基因转染多种肿瘤细胞^［7～10］. 基因修饰肿瘤细胞的治疗作用，一方面可提高肿瘤局部细胞因子的浓度，同时改变了肿瘤细胞的免疫原性， 诱导产生更多的肿瘤特异性的CTL等特异性效应细胞，又可产生大量的淋巴因子，这种正反馈效应能够导致全身系统性的抗肿瘤免疫学增强和产生一定的免疫记忆.

为了对骨肉瘤进行基因治疗，本室用逆转录病毒pDOR-neo为载体构建成功真核表达载体pDOR-IL-2，经脂质体转染法将IL-2基因转入人骨肉瘤细胞系Ma， 经G418筛选出阳性克隆，PCR证实Ma／IL-2基因组中含有IL-2 cDNA片段. 转基因后阳性克隆培养上清中可测到IL-2活性，表明人IL-2 cDNA已整合入人骨肉瘤细胞系Ma并获得表达， 也说明目的基因转染的有效应性，使这种方法制备的细胞可能成为治疗肿瘤的效应细胞. IL-2 cDNA转染的Ma／IL-2细胞与野生型Ma在体外培养观察发现前者形态有改变， Ma／IL-2细胞由原梭形变为圆形或多边形，而且细胞的体积稍增大，细胞呈现退行变. 细胞生长也有抑制，增长率减慢，其它学者也有类似发现^［11］，原因有待进一步研究.

PCR方法是一种快速、简便，准确扩增基因内某一特异DNA片段的方法. 本实验通过PCR，可以证实外源基因的插入及持续稳定表达，说明此转染方法的可行性. 通过IL-2基因转染的人骨肉瘤细胞Ma的体外生物学活性研究，为进一步研究其体内致癌及抗癌性创造条件.

作者简介：郑强，男，1967-12-18生，浙江省嘉善县人，汉族. 1998年第四军医大学博士生毕业，发表论文8篇，导师范清宇教授. 电话：(029)3524578-77695

作者单位：郑强范清宇第四军医大学唐都医院全军骨科中心，陕西 西安 710038)

参考文献

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