中国医学科学院学报1999年第21卷第3期

张权庚李洁张友会

摘要目的为分离转移相关基因，对两种干扰素诱导出现的差异表达cDNA片段进行序列测定。方法以α-和γ-干扰素分别处理MA891细胞，提取其RNA，用Northern blot进一步确定用差异显示法所获得的基因片段的差异性。选择表达差异明显的片段进行DNA测序。结果Northern blot结果表明，差异显示法得到的10个cDNA片段中，4个确属差异表达片段。测序结果显示，G15γ属尚无同源性报道的新基因；C4α与小鼠一种次要组织相容性复合体基因高度同源；T2γ与小鼠β-actin基因高度同源；T11γ与褐鼠高血压相关基因高度同源。结论确定了α-、γ-干扰素处理MA891细胞出现4条cDNA差异显示片段的核苷酸序列，为研究其与肿瘤转移的联系打下了基础。

关键词：mRNA差异显示干扰素肿瘤转移

笔者以前曾报道，干扰素能调变小鼠乳腺癌细胞的转移潜能。γ-干扰素增强其转移潜能，α-干扰素则减弱之^［1，2］。利用两种干扰素对MA891转移潜能的不同影响，笔者试图分离克隆与转移相关的基因。采用mRNA差异显示法(differential display)，寻找两种干扰素诱导MA891细胞出现的差异表达基因片段^［3］，本文是对这些cDNA片段的进一步研究。

1材料和方法

Northern杂交筛选MA891细胞培养、IFN处理及总RNA提取同既往研究^［3］。总RNA电泳及转膜，质粒DNA提取与PEG纯化方法参照文献［4］。

探针制备：(1) 酶切反应：取10 μg质粒DNA，加入10×EcoRⅠ buffer及50U EcoRⅠ，用双蒸水补足反应体积，37℃酶切2 h以上，琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2) 探针回收(Wizard^TM DNA clean up kit，Promega，USA): 待酶切完全后，用1%琼脂糖电泳分离酶切产物，切下探针凝胶条置于1.5 ml离心管中，加入200 μl 6 mol/L NaⅠ于60℃水浴溶解凝胶，加入1 ml混匀的树脂，室温放置5 min，以使树脂充分吸附DNA。再用套上柱子管的3 ml注射器推滤，去掉液体，加入2 ml 80%异丙醇推滤洗涤小柱子1次，取下小柱子置于1.5 ml离心管，13000 r/min离心20s， 再于室温放置5 min，然后加入适量的预热到65～75℃ TE或无菌水洗脱DNA， 12000 r/min离心3min，收集cDNA溶液，电泳鉴定并定量，-20℃保存。(3) 探针标记：按随机引物标记试剂盒(Promega，USA)说明书操作。

预杂交及杂交反应：将转有RNA的尼龙膜放入杂交袋中，加入适量预杂交液(0.5 mol/L Na₂ HPO₄，7%SDS，1 mol/L EDTA)，去气泡并封口，65℃保温3 h。剪开杂交袋倒出预杂交液。每袋加入适量预杂交液及标记探针，赶尽气泡，封口。置65℃水浴杂交48～72 h。用2×SSC/0.1% SDS于65℃水浴洗膜3遍，每遍30 min。待膜自然干后，用保鲜膜包好并在暗室用Kodak X光胶片于暗盒中压片，-70℃ 48 h自显影。常规洗片。

cDNA片段测序按Sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒(USB Corporation，USA)说明书进行操作。

质粒DNA变性：每个质粒按每个引物3～5 μg取量，用蒸馏水稀释至50 μl，其中含0.1体积的2 mol/L NaOH及2 mol/L EDTA，37℃孵育30 min，用4倍体积的无水乙醇及0.1体积的3mol/L乙酸钠(pH4.5～5.5)于-20℃沉淀过夜。12000 r/min离心15 min，沉淀DNA用75%无水乙醇沉淀1次，每3～5 μg质粒DNA用7 μl双蒸水溶解。

测序反应：每个DNA分别用M13(-40)引物及SP6引物进行双向测序。每个引物反应管取7 μl变性DNA(3～5 μg)，加入1 μl引物(0.5 pmol)及2 μl退火缓冲液(200 mmol/L NaCⅠ)。65℃反应2 min，于室温缓冲冷却约30 min。加入1 μl 0.1 mol/L DTT，2 μl稀释的Labeling mix，0.5 μl ³⁵S-dATP及2 μl稀释后的测序酶(含焦磷酸酶)。混匀并短暂离心，室温反应约5min。分别取3.5 μl标记反应产物加入每个经37℃预热的2.5 μl双脱氧核苷酸(ddA，ddG，ddC，ddT)管中，37℃反应，每管加入4 μl终止液混匀，短暂离心后置于冰上。

电泳及放射自显影：测序反应产物用含8 mol/L尿素8%聚丙烯凝胶电泳。加样前，样品80℃变性，每孔加样。20W恒功率电泳至溴酚蓝至凝胶底部时结束电泳，取凝胶置15%甲醇-5%冰乙酸中固定约30 min，用滤纸平贴于凝胶上并揭下凝胶，覆盖保鲜膜，于干胶机80℃干胶2 h。待胶干燥后揭除保鲜膜并用Kodak感光胶片于室温或-70℃曝光2～5 d，显影读片。

2结果

IFN处理及未处理的MA891细胞RNA变性琼脂糖凝胶电泳显示3种样本均没有降解。

Northern杂交结果显示，10个克隆的cDNA片段中，T2γ、C4α、T11γ、G15γ cDNA有杂交信号且差异表达。C4α在IFNα处理的MA891细胞中表达强于IFN-γ处理的MA891细胞，而T2γ、T11γ、G15γ 3个片段在IFNγ处理的MA891细胞中表达强于IFNα处理的MA891细胞(图1)，与差异显示结果一致。其他6个片段——T2α、T6α、T16α、T17α、T5α1、T5α2没有杂交信号或没有差异，属于假阳性条带，未作进一步研究。

图1Northern杂交结果

Fig 1Northern hybridization

results

a．C4α; b．T2γ; c．T11γ; d．G15γ;

e．β-actin as control

采用Sequenase Version 2.0测序试剂盒对T2γ、C4α、T11γ、G15γ cDNA片段进行测序(图2，3)。经查询：(1) G15γ是新序列，与已知序列没有同源性。(2) C4α与两个基因有很高的同源性，一个是小鼠线粒体基因组中的一个基因，另一个是小鼠“管家疏水蛋白”(domestics hydrophobic protein) mRNA序列； (3) T2γ与小鼠A-X actin有96%同源性，与小鼠β-actin约有90%同源性。(4) T11γ与褐鼠高血压相关mRNA基因有86%同源性。

图2T2γ、C4α、T11γ和G15γ cDNA片段序列

Fig 2Sequences of T2γ，C4α，T11γ，and G15γ cDNA fragments

图3部分测序结果

Fig 3Auto-radiographs of partial sequencing of C4α，T2γ，T11γ，and G15γ

3讨论

本研究对笔者差异显示反应得到的10个差异带(T2α、T2γ、C4α、T6α、T11γ、G15γ、T16α、T17α、T5α1、T5α2)^［3］进行Northern筛选，证明T2γ、C4α、T11γ、G15γ为差异表达cDNA片段，其他条带或没有杂交信号，或没有差异，说明从胶上分离的差异带有近70%的假阳性，这与其他一些mRNA差异显示结果一致^［5］。

本研究对T2γ、C4α、T11γ及G15γ进行测序并向GenBank查询基因的同源性。

G15γ与已知的基因没有同源性，为新发现的基因序列。其生物学功能值得深入研究。

C4α与两个基因有96%的同源性，一个是小鼠线粒体基因组中的一个基因，另一个是小鼠“管家疏水蛋白”(domestic hydrophobic protein) mRNA序列，后者也是小鼠线粒体编码的一种蛋白，两者可能为同一基因。小鼠“管家疏水蛋白”是小鼠母系传递的一种次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigen)^［6］，尚未见其有影响肿瘤转移的报道。本实验表明C4α经IFN-α处理表达增高，IFN-γ处理则表达降低，它是否为一种肿瘤转移的抑制蛋白，有待进一步研究。

T2γ与小鼠β-actin高度同源。Actin作为一种细胞骨架蛋白，与肿瘤转移的关系已有较多研究，当细胞内Actin增加时，细胞刚性增加，转移性减弱。但在本实验中T2γ被IFN-γ诱导表达，可见其可能不是影响MA891细胞转移性的重要因素。本实验按常规实验方法以β-actin作对照，但β-actin与T2γ的Northern杂交结果基本一致。既然β-actin已被调变，Northern杂交结果就不能以此作为对照，本实验以RNA琼脂糖电泳照片为对照，这在用其他mRNA差异显示方法分离肿瘤转移相关基因的研究中也见到使用^［7］。

T11γ与褐鼠高血压相关mRNA约90%同源。目前尚未见高血压相关mRNA与肿瘤转移关系的研究，因此该基因是否与MA891转移性相关亦有待进一步研究。

(致谢：本实验技术得到北京市肿瘤研究所柯杨老师及mRNA差异显示技术创立者Peng Liang指导)

张友会为通讯作者

作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所免疫室， 北京 100021

参考文献

1罗利群，张